中国沙棘乙醇提取物的体外及对HepG2细胞的抗氧化活性

苏海兰,魏 娟,毕 阳,*,李霁昕,Yury Zubarev,Alexander Kanarskiy

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.“利沙文科”西伯利亚园艺研究所,巴尔瑙尔 656045)

中国沙棘乙醇提取物的体外及对HepG2细胞的抗氧化活性

苏海兰1,魏 娟1,毕 阳1,*,李霁昕1,Yury Zubarev2,Alexander Kanarskiy2

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.“利沙文科”西伯利亚园艺研究所,巴尔瑙尔 656045)

本文从生化角度全面分析了中国沙棘乙醇提取物的体外抗氧化活性,并在评价细胞毒性的基础上,以HepG2细胞为模型,利用流式细胞仪评估了提取物的细胞抗氧化能力。结果表明,中国沙棘乙醇提取物对ABTS自由基具有良好的清除效果,当浓度为5 mg/mL时,其清除能力与阳性对照BHT相当;中国沙棘乙醇提取物对NO自由基也有良好的清除效果,但其整体清除能力不及BHT;当浓度为5 mg/mL时,中国沙棘乙醇提取物对亚油酸脂质过氧化表现抑制,但其抑制效果低于BHT;中国沙棘乙醇提取物的总抗氧化能力随浓度的增大而增强,当浓度为5 mg/mL时,其总抗氧化能力与同浓度下的BHT接近。在浓度为0.05～5 mg/mL范围内,中国沙棘乙醇提取物对HepG2细胞不显示毒性;当处理浓度为0.5、1、5 mg/mL时,中国沙棘乙醇提取物的阳性细胞率与阳性对照相比分别降低了75.22%、72.36%和78.2%。中国沙棘乙醇提取物不仅在体外条件下具有良好的抗氧化活性,而且在HepG2细胞内表现出良好的抗氧化能力。

沙棘,乙醇提取物,抗氧化,HepG2细胞

中国沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp. Sinensis)属胡颓子科沙棘属灌木[1]。广泛分布于我国的西北和华北等地,是我国栽培沙棘的主要品种。中国沙棘浆果富含维生素、黄酮及类胡萝卜素等多种活性成分[2],具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗衰老以及调节免疫等功能[3]。

抗氧化是多种沙棘活性成分的重要特性。范惠玲等[2]发现,中国沙棘浆果甲醇提取液能有效清除NO自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基,显示出较好的抗氧化活性。中国沙棘果渣总黄酮能够有效抑制油脂氧化、可清除超氧阴离子和羟自由基[4]。俄罗斯大果沙棘(H.rhamnoidesssp. Russia)浆果提取物不仅具有较好的体外抗氧化活性,而且可抑制癌细胞的增殖[5]。大果沙棘果渣黄酮可抑制结肠癌 HT29 细胞的生长,对该细胞DNA表现致损[6]。此外,印度柳叶沙棘(H.salicifoliaD. Don)浆果和叶片乙醇提取物也具有良好的自由基清除能力及抑制脂质过氧化作用,对人类神经细胞IMR32的氧化应激损伤具有保护作用[7]。同样,俄罗斯大果沙棘浆果黄酮对ABTS+·、DPPH·、羟自由基、超氧自由基均有很好的抑制效果[8]。然而,中国沙棘在生化水平的抗氧化评价并不系统,在细胞水平上也仅限于抑制细胞的生长。基于HepG2细胞模型反映中国沙棘细胞抗氧化活性的研究尚未见报道。

本文通过中国沙棘浆果乙醇提取物对ABTS、NO自由基清除效果、总抗氧化能力、抗亚油酸脂质过氧化能力的测定,以及对HepG2细胞内抗氧化能力的研究,验证中国沙棘乙醇提取物的抗氧化功能。以期扩大中国沙棘的应用范围,为筛选天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘浆果于2012年11月采自甘肃华池高原圣果基地,纸箱包装次日运至本实验室于-80 ℃下贮藏待用;HepG2(人肝癌细胞) 上海拜力生物有限公司,液氮冻存;MTS Promega公司;FBS、DMEM、0.25%胰酶(含EDTA) Hyclone公司;ABTS、DCFH-DA Sigma-Aldrich公司;2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)及其余试剂 国产分析纯。

UV-2450型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;V111584 型iMARK酶标仪 美国BIO-RAD公司;Cell Lab Quanta SC型流式细胞仪 美国Beckman公司;DH-1850R型高速台式冷冻离心机 上海德洋意邦仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乙醇提取物的制备 参照梁楷等[9]方法,准确称取2.0 g沙棘浆果置于研钵中,研磨捣碎,采用乙醇浓度51%,料液比1∶22,在86 ℃下水浴回流提取1 h,离心收集于4 ℃避光保存。

1.2.2 HepG2细胞培养 参照Wen等[10]方法,将HepG2细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中,且将其置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养,每2～3 d用含0.25% EDTA的胰酶消化传代。当细胞生长状态良好,呈对数生长期时进行实验。

1.2.3 乙醇提取物清除ABTS自由基的测定 参照Chun等[11]方法。将5 mL的7 mmol/L ABTS和88 μL的140 mmol/L高硫酸钾混合,在室温,避光的条件下静置过夜,形成ABTS自由基储备液。使用前用无水乙醇(1∶88)稀释成工作液,后将工作液于30 ℃、734 nm波长下确定其吸光值是否在0.70±0.02。若在0.70±0.02内,则可进行实验。用51%乙醇分别配制浓度为0.5、1、2、3、4、5 mg/mL的沙棘乙醇提取物样品溶液,以抗氧化剂BHT溶液(0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)作为阳性对照。取0.1 mL样液,加入4 mL ABTS自由基溶液,30 ℃下混合10 s,在734 nm测其吸光值A。51%乙醇替代样液作为阴性对照组,于734 nm处测定吸光值A0。清除率由式(1)计算:

式(1)

1.2.4 乙醇提取物清除NO自由基的测定 参照Dong等[12]的方法。在反应中,取10 mmol/L亚硝基铁氰化钠溶液5 mL加入试管中,再分别加入10 mg/mL样品(沙棘乙醇提取物)0.5、1、2、3、4、5 mL,补蒸馏水至10 mL,混合均匀后,在室温下反应150 min。51%乙醇取代样液作为阴性对照组,以BHT作为阳性对照。溶液反应后,添加Griess试剂(l%对氨基苯磺酸,2%磷酸,0.1% N-1-萘乙二胺盐酸盐)0.5 mL。在546 nm下,测定所形成的发色基团的吸光值。清除率计算见式(2):

式(2)

其中:A0为空白组的吸光度,A为加沙棘乙醇提取物后的吸光度。

1.2.5 乙醇提取物抑制亚油酸脂质过氧化的测定 参照张京芳等[13]的方法。分别配制5 mg/mL的沙棘乙醇提取物溶液、BHT溶液作为样品液,取1 mL样品液于具塞试管中,然后分别加入1 mL 2.5%亚油酸(v/v)溶液,2 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0),1 mL蒸馏水,于40 ℃恒温下培养。取培养液0.1 mL,按顺序加入4.7 mL乙醇(75%)、0.1 mL硫氰酸铵(30%)、0.1 mL氯化亚铁(0.02 mol/L,用3.5%盐酸配制),混合均匀后,室温下准确反应3 min,在波长500 nm下测吸光值A,51%乙醇取代替样液作为阴性对照组A0。抑制率计算见公式(3):

式(3)

1.2.6 乙醇提取物总抗氧化能力的测定 参照Prieto等[14]的方法稍作修改。取0.4mL样品液(0.5、1、2、3、4、5mg/mL),再加入4mL磷钼试剂(内含0.6mol/L浓硫酸、28mmol/L磷酸钠、4mmol/L钼酸铵),混合均匀后,于95 ℃水浴中保温90min,取出冷却至室温,阴性对照液用0.4mL溶剂代替样品液。以BHT为阳性对照,于 695nm波长处测定吸光度。依据吸光度变化来检测总抗氧化性能的高低。

图1 中国沙棘乙醇提取物对ABTS自由基(A), NO自由基(B), 亚油酸脂质过氧化(C),总抗氧化能力(D)的影响 Fig.1 Effects of ethanol extracts of Chinese seabuckthorn on ABTS free radicals(A), NO free radicals(B),linoleic acid lipid peroxidation(C),total antioxidant capacity(D)

1.2.7 乙醇提取物对HepG2细胞毒性的测定 参照顾梅等[15]的方法稍作修改。收集对数期HepG2细胞,调整细胞悬液浓度,将其接种于96孔培养板中,接种使待测细胞密度1000～10000cells/孔,置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24h使其贴壁,培养24h后加入不同浓度的沙棘乙醇提取物,每个浓度设6个复孔,于5% CO2,37 ℃继续孵育24 h;然后加MTS试剂,再继续孵育1～3 h后,在490 nm处测量各孔的吸光度值A1,以单纯培养液作为空白孔,测定吸光度值为A0,以未做任何处理作为对照,测定吸光度值A。细胞存活率见公式(4)计算:

式(4)

1.2.8 乙醇提取物细胞内抗氧化活性测定 参照张红城等[16]的方法。取对数期的HepG2细胞,调整细胞悬液浓度接种于6孔培养板中于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后去掉原培养液,用预冷的PBS清洗1次;加入不同浓度的沙棘乙醇提取物处理30 min,之后去掉培养基用预冷的PBS清洗一次,加入25 μmol/L DCFH-DA溶液,5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养30 min,去掉培养基后用预冷的PBS清洗3次,以充分洗去未进入细胞内的探针。再加入15 mmol/L H2O2刺激40 min,收集细胞并制成细胞悬液,用流式细胞仪检测荧光强度,激发波长为488 nm,发射波长为525 nm。

上述各项测定均重复进行3次。

1.3 数据处理

全部数据采用Excel 2007计算平均值及标准偏差。

2 结果与分析

2.1 中国沙棘乙醇提取物的体外抗氧化能力

中国沙棘乙醇提取物对 ABTS自由基具有良好的清除能力,在0～5 mg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系,当浓度为5 mg/mL时,其清除率已接近同浓度阳性对照BHT。阳性对照BHT显示出更好的 ABTS自由基的清除能力,当浓度为0.5 mg/mL时,其清除率就已达90%(图1A)。而阴性对照对ABTS自由基始终未表现清除作用。

中国沙棘乙醇提取物对NO自由基也有良好的清除效果,随着浓度的提高,对NO自由基的清除能力也逐渐增强,但整体清除能力不及阳性对照BHT,当浓度为0.5 mg/mL时,乙醇提取物对NO自由基的清除率低于BHT 12.7%,当浓度为5 mg/mL时,乙醇提取物对NO自由基的清除率是阳性对照BHT的81%(图1B),而阴性对照对NO自由基始终未表现清除作用。

当浓度为5 mg/mL 时,中国沙棘乙醇提取物和BHT 均对亚油酸的脂质过氧化作用表现抑制,但中国沙棘乙醇提取物的抑制效果不及BHT,而与对照相比,中国沙棘乙醇提取物对亚油酸脂质过氧化的抑制率占对照的61.2%(图1C)。

中国沙棘乙醇提取物的总抗氧化活性随浓度的增大而增强,当浓度为5 mg/mL时,其总抗氧化活性与同浓度下的阳性对照BHT接近,但中国沙棘乙醇提取物的总抗氧化活性不及BHT(图1D)。阴性对照的总抗氧化活性始终维持在较低的水平。

2.2 中国沙棘乙醇提取物对HepG2细胞的毒性及细胞内抗氧化活性的影响

2.2.1 对HepG2细胞的毒性 中国沙棘乙醇提取物在0.05～5 mg/mL时,对HepG2细胞的存活率无抑制作用(图2);且在0.1～5 mg/mL时,提取物反而对HepG2细胞的存活率有促进作用,但在整个浓度范围内中国沙棘乙醇提取物对HepG2细胞的存活率与对照组一致,证明在实验浓度(0.05～5 mg/mL)内对细胞无毒作用,故后继实验中提取物浓度选定在5 mg/mL以内进行。

图2 不同浓度中国沙棘乙醇提取物 对HepG2细胞存活率的影响Fig.2 Effects of ethanol extracts of Chinese seabuckthorn at different concentrations on the viability of HepG2 cells

2.2.2 中国沙棘乙醇提取物的细胞内抗氧化活性 阴性对照(NTC)未经过氧化氢刺激,HepG2细胞阳性细胞率相对较低,仅为6.87%;当用过氧化氢处理后,HepG2细胞内显示出高含量的活性氧,且阳性对照(PTC)的阳性细胞率达到了84.17%;而HepG2细胞经乙醇提取物(0.5、1、5 mg/mL)处理后,其阳性细胞率与阳性对照相比分别降低了75.22%、72.36%和78.2%。由此表明,中国沙棘乙醇提取物在HepG2细胞内表现出良好的抗氧化能力(图3)。

图3 不同浓度中国沙棘乙醇提取物 对HepG2细胞阳性细胞率的影响Fig.3 Effect of ethanol extracts of Chinese seabuckthorn at different concentrations on positive cell ratio of HepG2 cells注：Blank(空白);NTC(阴性对照);PTC(阳性对照); A, B, C分别为0.5,1,5(mg/mL)提取物处理组。

3 结论与讨论

沙棘浆果富含类黄酮、多酚、维生素等多种活性成分[17],具有良好的抗氧化性[18]。本研究发现,中国沙棘浆果乙醇提取物对ABTS、NO自由基具有良好的清除能力,且在浓度为5 mg/mL时，提取物的总抗氧化能力与阳性对照BHT的总抗氧化能力相当。此外,中国沙棘浆果乙醇提取物还能有效清除HepG2细胞内的活性氧。虽然中国沙棘浆果的体外抗氧化研究已有零星报道,但有关中国沙棘浆果乙醇提取物体外生化水平抗氧化活性的系统分析以及应用HepG2细胞模型的细胞抗氧化研究属首次报道。

本研究结果显示,中国沙棘表现出的良好抗氧化活性,与采用乙醇处理浆果后大量黄酮等酚类物质溶出密切相关。该结果与前人采用乙醇提取杨梅和葡萄皮渣中的酚类物质结果类似[19-20]。由于乙醇具备良好溶解性及细胞穿透力,当用一定体积分数的乙醇处理果实原料时,使得组织细胞内外的浓度差变大,从而促进了黄酮的溶出[21]。

本研究发现,中国沙棘浆果乙醇提取物除了对ABTS自由基具有良好的清除作用外,还可抑制亚油酸脂质过氧化。而该结果与俄罗斯大果沙棘黄酮粗提物对ABTS自由基具有清除能力[8],及印度柳叶沙棘浆果乙醇提取物可抑制亚油酸脂质过氧化[7]的结果类似。本研究还发现,中国沙棘浆果乙醇提取物可有效清除NO自由基,且清除效果明显优于甲醇提取物对NO自由基的清除效果[2]。本研究采用的四种体外抗氧化评价方法均是基于抗氧化剂具有良好的供氢或供电子的能力。而黄酮正是通过分子中的酚羟基提供氢原子与自由基反应产生较稳定的半醌式自由基而实现清除自由基的目的[22]。因此,中国沙棘乙醇提取物所表现出良好的抗氧化活性与其中较高的总黄酮含量密切相关[23]。

上述研究均为基于生化水平的体外测定,并不能准确反映抗氧化成分在机体内部的生物利用率、吸收、运输、代谢及其在机体内有效的作用浓度。因此,一种基于细胞模型的生物方法,即细胞抗氧化(cellular antioxidantactivity,CAA)法被广泛用于抗氧化活性的评价体系中[24]。与传统化学法相比,CAA法更能准确预测植物化学物质在机体内的抗氧化效果[25]。本研究结果显示,中国沙棘乙醇提取物可以有效降低HepG2细胞的阳性细胞率。该结果与印度柳叶沙棘浆果乙醇提取物改善淋巴细胞的抗氧化活性[26],及黑莓粗提物对人类肠道细胞INT-407具有细胞抗氧化能力[27]的结果类似。

有研究表明,葡萄的总抗氧化活性与其总酚及总黄酮含量呈显著相关性,其CAA活性与葡萄中的总黄酮具有显著相关性[28]。也有人发现,具有某些特殊结构的类黄酮的CAA活性较强[29],这些物质包括异鼠李素、山奈酚、杨梅酮等[30]。由于异鼠李素、山奈酚、槲皮素等化合物普遍存在于中国沙棘浆果中[31]。因此,推测中国沙棘浆果的细胞抗氧化活性可能与这些成分密切相关。此外,中国沙棘还含有多糖、有机酸、类胡萝卜素、维生素等多种抗氧化成分,因此,其良好的抗氧化活性除了与其高含量的总酚及总黄酮相关外,也与这些组分相关,并且是多种组分之间相互协同作用的结果[32]。但何种组分对中国沙棘浆果的抗氧化贡献最大,这些组分之间如何发挥抗氧化协同作用尚有待今后进一步研究。

综上所述,中国沙棘乙醇提取物可有效清除ABTS自由基、NO自由基,在亚油酸脂质过氧化方面具有较好的抑制效果,并表现出良好的总抗氧化能力,当浓度为5 mg/mL时,其ABTS自由基的清除效果及总抗氧化能力与阳性对照BHT相当。此外,中国沙棘乙醇提取物对HepG2细胞也具有良好的抗氧化能力。中国沙棘良好的抗氧化活性与其较高的总酚及总黄酮含量密切相关。

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Antioxidant activity of ethanol extracts from Chinese seabuckthorn berriesinvitroand on HepG2 cells

SU Hai-lan1,WEI Juan1,BI Yang1,*,LI Ji-xin1,Yury Zubarev2,Alexander Kanarskiy2

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Lisavenko Research Institute of Horticulture for Siberia,Barnaul 656045,Russia)

In this research,the antioxidant capacity of ethanol extracts from Chinese seabuckthorn berries was comprehensively analyzedinvitroat biochemical level. On the basis of evaluation of cytotoxicity,flow cytometry method was used to analysis the cellular antioxidant activity of the ethanol extracts in HepG2 cells. The results showed that the extracts had an effectively removal effect on ABTS free radicals,when the concentration reached at 5 mg/mL,the scavenging rate was similar to that of positive control BHT. The extracts also effectively inhibited NO free radicals,however,the inhibition rate was weaker than that of BHT at the same concentration. The extracts at 5 mg/mL significantly inhibited lipid peroxidation,however,the inhibition rate was lower than that of BHT at the same concentration. The total antioxidant capacity was enhanced as the concentration increased,when the concentration reached at 5 mg/mL,the total antioxidant capacity was similar to that of BHT. Among the concentration of 0.05～5 mg/mL,the extracts showed no cytotoxicity. At the concentration of 0.5,1,5 mg/mL,the positive cells rate of extracts was reduced by 75.22%,72.36% and 78.2% compared with the positive control respectively. It is suggested that ethanol extracts from Chinese seabuckthorn not only had a stronger antioxidant capacity at biochemical level,but also had an antioxidant ability at the cellular level.

seabuckthorn;ethanol extracts;antioxidant;HepG2 cells

2016-09-09

苏海兰(1992-)，女，硕士研究生，研究方向:果蔬采后生物学与技术,E-mail：18298332380@163.com。

*通讯作者:毕阳(1962-)，男，博士，教授，研究方向:果蔬采后生物学与技术,E-mail：biyang@gsau.edu.cn。

国家科技部国际合作专项2014DFR31230。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0093-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.009