猴头菌液体固体发酵产物多糖抗氧化活性研究

盛悦，何音华，沈月，李雪，王旭东，蔡丹

猴头菌液体固体发酵产物多糖抗氧化活性研究

盛悦，何音华，沈月，李雪，王旭东，*蔡丹

（吉林农业大学吉林食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

通过还原能力的测定和DPPH·，O2-·，·OH清除率的测定，体外抗氧化试验结果表明，猴头菌多糖具有较强的抗氧化活性，在试验的3种多糖中，抗氧化能力依次为固态发酵产物多糖HeP3＞液体发酵菌丝体多糖HeP1＞发酵液多糖HeP2。

猴头菌；多糖；提取；抗氧化活性

0 引言

猴头菌（Hericiumerinaceus），是一种著名的食药兼用真菌[1-2]，其发酵产物中的有效成分多糖物质被广泛应用于研究肿瘤、治疗胃炎及消化道溃疡等疾病，目前已经有临床运用的实例[3-5]。相关研究证明，猴头菌所含的多糖物质不仅有抗氧化抗衰老[6-7]、降血糖血脂[8-9]、抗肿瘤[10]的功能，还有免疫调节[11-14]等生物活性。相关学者对此做了大量的研究来帮助分析猴头菌发酵产物中的某些化学成分和对应的功能活性之间的关联[3-5，15-22]，其中有关于多糖物质在抗氧化性的研究报道较少。相关课题组多年来一直致力于大型真菌改性玉米醇溶蛋白的系统研究，前期研究成果表明，以玉米醇溶蛋白为主要成分进行发酵，其产物中多糖产量较高，并具有一定的生理活性。因此，试验以前期研究成果为基础，开展以猴头菌发酵产物为原料进行多糖的提取及体外抗氧化试验测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

猴头菌菌种，吉林农业大学小麦和玉米深加工国家工程实验室提供。

1.1.2 菌种保存斜面培养基

固体PDA培养基。

1.1.3 试剂

玉米蛋白粉，吉林中粮生化能源销售有限公司提供；玉米粉、马铃薯，市售；无水乙醇、苯酚、浓硫酸、白砂糖、葡萄糖、琼脂、酵母浸粉，以及MgSO4，KH2PO4均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；HZQ-F160型全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品；LD5-2B型离心机，北京雷勃尔离心机有限公司产品；RE-52A型旋转蒸发器、SHZ-III型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂产品。

1.3 方法

1.3.1 猴头菌的活化

将4℃贮藏的猴头菌菌种转接至新鲜的PDA斜面培养基，置培养箱中于27℃下培养至第12天时采用。

1.3.2 种子培养基的制备

可溶性淀粉2%，葡萄糖3%，酵母浸粉1%，七水合硫酸镁0.06%，磷酸二氢钾0.3%，自然pH值，121℃下灭菌20min。

1.3.3 液体深层发酵培养基的制备

玉米蛋白粉12%，葡萄糖3.5%，磷酸二氢钾0.35%，VB10.0015%，于121℃下灭菌20min。接种量10%，培养温度25℃，初始pH值5.5，摇床转速150r/min。

1.3.4 固体发酵培养基的制备

玉米蛋白粉30g，葡萄糖4%，碳酸钙0.75%，料液比1∶1.25，于121℃下灭菌20min。接种量16%，pH值5.5，培养温度25℃，培养时间15d。1.3.5粗多糖样品的制备

猴头菌液体发酵培养6d后，用布氏漏斗分离发酵产物，分别获得菌丝体和发酵液。①将发酵液置于圆底烧瓶中，于60℃条件下减压浓缩，加入预冷的95%乙醇溶液达到终质量分数80%，调节pH值为6，于4℃条件下醇沉12h，然后离心收集沉淀，用75%的乙醇清洗沉淀，直至无还原糖反应，再按照无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序进行清洗，水浴溶解，以转速4500r/min离心10min后得上清液。②采用Sevag法[23]脱去蛋白，加入Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），漩涡混匀器快速振荡20min后静置10min，以转速4500r/min离心15min，除去含蛋白的部分，重复多次，直至用考马斯亮蓝法检测无蛋白。③加入2%的活性炭，水浴温度60℃，水浴时间30min，不断搅拌进行脱色，然后过滤得到粗多糖，储存备用。④用蒸馏水冲洗过滤得到的菌丝体，直至无发酵液残留，然后于60℃烘干至恒质量，粉碎过60目筛，取5g样品，超声功率600W，超声时间30min，超声温度80℃，料液比1∶35，提取3次，醇沉及其他操作同上。⑤猴头菌固态发酵培养15d后，在60℃的条件下烘干至恒质量，粉碎过60目筛，取5g样品，超声功率600W，超声时间30min，超声温度80℃，料液比1∶30，提取3次，醇沉及其他操作同上。

1.3.6 纯化

将制备粗多糖样品溶于蒸馏水中，置于透析袋（8000～10000Da）中，自来水流动透析48h，然后用蒸馏水透析48h（每隔6h换1次蒸馏水）；减压浓缩，真空冷冻干燥得精制多糖，备用；精制多糖分别经DEAE-52型纤维素离子交换柱（1cm×20cm）层析和SephadexG-75型凝胶柱（2.5cm×50cm）层析后，进行体外抗氧化活性测定。

1.3.7 还原能力的测定

试验利用了普鲁士蓝法[24-25]，以抗坏血酸为阳性对照，对猴头菌的发酵产物中多糖还原能力进行分析。

计算公式为：

式中：A——样品OD值；

A0——空白OD值。

1.3.8 DPPH·清除率的测定

采用改良的DPPH分析法，以抗坏血酸为阳性对照，测定了猴头菌发酵产物中多糖的抗氧化活性。

计算公式为：

式中：A0——空白组OD值；

A——样品OD值；

A1——对照组OD值。

试验过程中采用改良的邻苯三酚法，进行猴头菌发酵产物中多糖的抗氧化活性测定，以抗坏血酸为阳性对照。

计算公式为：

式中：A0——空白组OD值；

A——样品OD值；

A1——对照组OD值。

1.3.10 ·OH清除率的测定

试验以Fenton法为基础加以改良，进行猴头菌发酵产物中多糖的抗氧化活性测定，以抗坏血酸为阳性对照。

计算公式为：

式中：Ac——空白组OD值；

Ai——样品OD值；

Aj——对照组OD值。

2 结果与分析

2.1 猴头菌发酵产物多糖总还原能力测定

机体内部的Fe2+可催化脂质过氧化，从而引起多种疾病，并具有较高的反应活性，故对金属离子Fe2+的鳌合能力被用于评价抗氧化剂清除自由基的重要指标之一。其中，HeP1是液体发酵菌丝体多糖，HeP2是发酵液多糖，HeP3是固态发酵产物多糖。

猴头菌发酵产物多糖和VC的还原能力见图1。

图1 猴头菌发酵产物多糖和VC的还原能力

由于吸光度越大，还原力越强，抗氧化能力越好。由图1可知，各样品的还原能力随着质量浓度的增大而逐渐增强。其中，HeP1低质量浓度时增长速度很快，而HeP3前期增长速度较慢；当质量浓度达到5mg/mL时，还原能力高于HeP1，但仍低于VC的还原能力。

2.2 猴头菌发酵产物多糖DPPH·清除能力

DPPH·是一种比较稳定的自由基，已广泛用于评估抗氧化剂清除自由基活性中。

猴头菌He-02发酵产物多糖和VC对DPPH·的清除能力见图2。

图2 猴头菌He-02发酵产物多糖和VC对DPPH·的清除能力

由图2可知，随着试验样品质量浓度的增大，各样品对DPPH·的清除能力随之逐渐增强，当质量浓度为5mg/mL时，HeP3清除能力最强，HeP2的清除能力相对较弱；且当质量浓度逐渐增大，HeP3与VC的抗氧化性逐渐靠近。当样品质量浓度为5mg/mL时，3种多糖样品对DPPH·的清除能力按次序为59.33%，48.47%，66.14%。

图3 猴头菌He-02发酵产物多糖和VC对O2-·的清除能力

2.4 猴头菌发酵产物多糖·OH清除能力

·OH在众多自由基中反应活性最强，它可引起周围生物大分子的严重损伤，进而引起机体衰老等。因此，·OH清除率是评价抗氧化作用的重要指标。

猴头菌He-02发酵产物多糖和VC对·OH的清除能力见图4。

图4 猴头菌He-02发酵产物多糖和VC对·OH的清除能力

·OH被公认为活性最强的自由基，也是评价抗氧化活性的重要指标之一。由图4可知，HeP3对于·OH的清除能力最强，HeP2对·OH的清除能力最弱。

3 结论

体外抗氧化试验结果表明，猴头菌多糖具有较强的抗氧化活性，在试验的3种多糖中，抗氧化能力依次为固态发酵产物多糖HeP3＞液体发酵菌丝体多糖HeP1＞发酵液多糖HeP2。试验中，固体发酵产物多糖抗氧化活性略优于液体发酵，可能是由于不同发酵形式的培养基含水量不同，而含水量影响菌种的生理代谢过程，进而影响多糖组成，从而影响多糖的抗氧化活性。

[1]王俊，图力古尔，高兴喜.中国猴头菌属真菌分子系统学研究[J].中国食用菌，2011（4）：51-53，60.

[2]谭旭华.猴头菌属（Hericiumerinaceus）菌种鉴定[D].长春：吉林农业大学，2006.

[3]麻兵继，徐俊蕾，文春南，等.猴头菌子实体化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2012（9）：1165-1168，1175.

[4]张鹏，图力古尔，包海鹰.猴头菌属真菌化学成分及药理活性研究概述[J].菌物研究，2011（1）：54-62.

[5]宋慧.小刺猴头菌[Hericiumcaput-medusae（Bull.:Fr）. Pers.]化学成分研究及菌种鉴定[D].长春：吉林农业大学，2003.

[6]周慧萍，刘文丽，陈琼华，等.猴头菌多糖的抗衰老作用[J].中国药科大学学报，1991（2）：86-88.

[7]潘伟，刘瑞娜，谭琦，等.猴头菌提取物抗氧化活性研究[J].食用菌学报，2012，19（2）：95-99.

[8]张文，陈建伟，李祥，等.猴头菌粉多糖对糖尿病小鼠血糖血脂的影响[J].药学与临床研究，2012（1）：24-27.

[9]韩爱丽.珊瑚状猴头菌多糖降血胆固醇作用及机制的研究[D].太谷：山西农业大学，2014.

[10]郁利平，王莉馨，赵清池.猴头多糖抑制肿瘤生长机理初探[J].白求恩医科大学学报，1992，18（6）：532-533.

[11]杨焱，周昌艳，王晨光，等.猴头菌多糖调节机体免疫功能的研究[J].食用菌学报，2000，7（1）：19-22.

[12]杨焱，周昌艳，白韵琴，等.猴头菌子实体和菌丝体多糖的分离纯化与理化特征的比较[J].菌物系统，2001，20（3）：397-402.

[13]杨焱，唐庆九，周昌艳，等.猴头菌提取物对大鼠胃黏膜损伤保护作用的研究[J].食用菌学报，1999，6（1）：14-17.

[14]孟俊龙，田敏，冯翠萍，等.珊瑚状猴头菌营养成分及其多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中国食品学报，2016（2）：50-55.

[15]石勇民，苏凤岩.猴头多糖的初步提取及分析[J].微生物学杂志，1989（2）：47-48.

[16]王明霞，管笪，经美德.五株优良猴头菌营养成分的分析及其利用的研究[J].微生物学通报，1992（2）：68-72.

[17]TInakuma，KAizawa，RYamauchi，etal.Structuralfeatures ofpolysaccharideofhericiumerinaceum-hydrocolloids[J]. Hydrocolloids，2000（1）：139-143.

[18]王昭晶，梁忠岩，罗巅辉.小刺猴头菌子实体水溶性多糖HPⅠ的结构研究[J].高等学校化学学报，2004（8）：1474-1476.

[19]JiaLM，LiuL，DongQ，etal.Structuralinvestigationofa novelrhamnoglucogalactanisolatedfromthefruitingbodies ofthefungusHericiumerinaceus[J].CarbohydrateResearch，2004（16）：2667-2671.

[20]史军花，梁忠岩，耿慧，等.猴头菌发酵菌丝水溶性多糖HPA的结构确定[J].分子科学学报，2003（2）：123-126.

[21]耿慧，梁忠岩，赵伟，等.碱提猴头发酵菌丝体水溶性多糖HPP的结构确定[J].分子科学学报，2004（2）：31-34.

[22]陈慧，陆震鸣，徐国华，等.猴头菌发酵菌粉成分分析[J].食品研究与开发，2015（14）：95-97.

[23]BoxallAB，JohnsonP，SmithEJ，etal.Uptakeof veterinarymedicinesfromsoilsintoplants[J].Journalof Agricultural&FoodChemistry，2006，54（6）：2288-2297.

[24]王会，郭立，谢文磊.抗氧化剂抗氧化活性的测定方法（一）[J].食品与发酵工业，2006（3）：92-98.

[25]王晓宇，杜国荣，李华.抗氧化能力的体外测定方法研究进展[J].食品与生物技术学报，2012（3）：247-252.◇

StudyonAntioxidantActivityofPolysaccharidefromHericiumerinaceusLiquid andSolidFermentationProducts

SHENGYue，HEYinhua，SHENYue，LIXue，WANGXudong，*CAIDan
（NationalEngineeringLaboratoryforDeepProcessingofWheatandCorn，CollegeofFoodScienceandEngineering，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin130118，China）

Throughdeterminationsofreducingcapacity，DPPH·freeradicalscavengingrate，·scavengingrate，and·OH scavengingrate，thein-vitroantioxidanttestresultshaveshownthatthefermentationbrothpolysaccharideofHericium erinaceushasastrongabilityofscavengingthefreeradical.Amongthethreekindsofpolysaccharidesinthisexperiment，the antioxidantcapacityofHeP3＞HeP1＞HeP2.

Hericiumerinaceus；polysaccharide；exaction；antioxidantactivity

S646

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.031

1671-9646（2017）04b-0009-04

2017-03-01

吉林省科技发展计划（20140204011NY）；国家现代农业产业技术体系（CARS02-29）。

盛悦（1992—），女，在读硕士，研究方向为食品生物化学工程与功能性食品。

*通讯作者：蔡丹（1980—），女，博士，副教授，研究方向为乳品科学与发酵工程。