NF—κB/TLR4信号通路在急性胰腺炎大鼠肝损伤中的表达及PPAR—γ激动剂的保护作用

陆贝　于源泉　殷俊杰

[摘要] 目的 基于NF-κB/TLR4信号传导通路探讨γ激动剂罗格列酮对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤的保护作用。方法 72只SD大鼠随机分为假手术组（SO组）、SAP模型组、罗格列酮处理组（ROSI组），每组24只，各组再随机分为术后6 h、12 h、24 h组，每组8只。SAP模型组采用腹腔注射L-精氨酸法制备，ROSI组在SAP造模后30 min从股静脉注射10%罗格列酮溶液6 mg/kg，SO组仅腹腔注射等体积生理盐水。制模后观察大鼠肝脏组织病理变化，测定肝组织TLR4、NF-κB、Bax、Bcl-2等因子及外周血TNF-α、IL-1β、IL-6、ALT、AST、LDH含量。 结果 ROSI组大鼠肝细胞病理损害较SAP组减轻，肝组织NF-κB、TLR4、Bax、Bcl-2、肝细胞凋亡指数与SAP组比较有明显差异（P<0.05），外周血TNF-α、IL-1β、IL-6、ALT、AST、LDH含量与SAP组比较明显下降（P<0.05）。 结论 PPAR-γ激动剂可能通过抑制NF-κB/TLR4信号传导通路的活性，下调下游促炎细胞因子水平，从而减轻急性胰腺炎过程中的肝细胞损伤。

[关键词] 重症急性胰腺炎；过氧化物酶体增殖物激活受体；核因子-κB；Toll样受体

[中图分类号] R576 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）33-0030-04

[Abstract] Objective To discover the protective effect of PPAR-γ agonists rosiglitazone on injured liver cells in rats correlate with NF-kappa B/TLR4 signal pathway during severe acute pancreatitis. Methods 72 SD rats were randomly divided into sham operation （SO） group （n=24）， SAP model （SAP） group （n=24）， rosiglitazone （ROSI） group （n=24）. Each group was divided into 6 h， 12 h， and 24 h group（n=8） after operation. SAP rats model were did via peritoneal injection of L-arginine. Rats in ROSI group were injected with 6 mg/kg of 10% rosiglitazone via femoral vein 30 min after SAP models were succeed. Sham group was peritoneal injected of same volume NS as SAP group. Pathological changes of liver tissue after operation， TLR4， NF-κB， Bax， Bcl-2 in liver tissue were tested. Serum TNF-α， interieukin-1β， interieukin-6， ALT， AST， LDH were also determined. Results The pathological injuries of liver cell were relieved in ROSI group compared with SAP group. There were significant differences in NF-κB， TLR4， Bax， Bcl-2 and liver cell apoptosis index between ROSI and SAP group（P<0.05）. TNF-α， IL-1β， IL-6， ALT， AST and LDH were decreased in ROSI group when compared with those in SAP group（P<0.05）. Conclusion The liver cell injury during SAP may relived by PPAR-γ agonists， the probable reason is that PPAR-γ agonists suppress NF-kappa B/TLR4 signal pathway， and reduce inflammatory cytokines.

[Key words] Severe acute pancreatitis； Peroxisome proliferator activating receptor； Nuclear factor-kappa B； Toll-like receptor

重癥急性胰腺炎（SAP）最常见的致命并发症是多器官功能不全，临床上尚无特异性治疗能有效阻断病程的进展，学术上也颇具争议。SAP常见胰外损害之一是肝损伤，亦是导致多器官功能障碍综合征（MODS）患者死亡的主要原因。罗格列酮（rosiglitazone，ROSI）是人工合成的PPAR-γ激动剂，临床上早已作为胰岛素增效剂用于2型糖尿病治疗。1998年研究证实PPAR-γ通过抑制NF-κB活化具有抗炎和免疫调节作用[1]，Hashimoto等[2]学者2003年初次发现急性胰腺炎大鼠的治疗靶点PPAR-γ，但此后的实验未能阐述其具体机制。本实验通过对SAP大鼠静脉注射罗格列酮，观察其对大鼠肝脏NF-κB和TLR4表达的影响及肝损伤的保护作用，进一步探讨PPAR-γ激动剂对胰腺炎的治疗作用与NF-κB/TLR4信号传导通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性清洁级SD大鼠72只，质量255～315 g，浙江中医药大学动物实验中心购入。戊巴比妥钠、L-精氨酸（Sigma，USA）、罗格列酮（Cayman，USA）、Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4单克隆抗体（Santa Cruz，USA），TUNEL盒（Takara，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 72只大鼠分为SAP模型组（SAP组，n=24）、罗格列酮组（ROSI组，n=24）、假手术组（SO组，n=24），各组再随机分为术后6 h、12 h、24 h组，每组8只。大鼠腹腔内注射2.5%戊巴比妥钠0.2 mL/100 g麻醉，股静脉插管用微泵持续输液。SAP组：腹腔两次注射法建立大鼠SAP模型：先后两次（间隔1 h）向腹腔内注射L-精氨酸2.0 g/kg，浓度20 g/L，即完成SAP制模。SO组：仅向腹腔内两次注射等体积生理盐水。ROSI组：造模SAP成功后30 min，经股静脉注射10%罗格列酮溶液6 mg/kg，术后相应时间点剖杀。

1.2.2 肝脏组织形态学观察 大鼠剖杀后取左肝叶组织以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE染色后光镜下观察。

1.2.3 肝脏TLR4、NF-κBp65蛋白水平检测 部分右肝叶组织采用免疫组化法和免疫印迹（Western blot）法检测Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）和核转录因子-κBp65（nuclear transcription factor-κBp65，NF-κBp65）的表达，具体操作参照TLR4和NF-κBp65检测试剂盒说明书。结果判定：光镜下观察，以胞质出现黄染为阳性细胞，随机选取5个视野利用图像分析系统分析目的蛋白与内参蛋白灰度比值，计算相对含量，以阳性单位（positive unit）PU值大小定量[3]。

1.2.4 肝脏Bax、Bcl-2、AI检测 SABC染色法检测肝Bcl-2相关x蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），结果按PU值定量[3]。TUNEL染色法检测肝细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.2.5 血清生化指标检测 心脏采血后，使用全自动生化分析仪测定血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interieukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（interieukin-6，IL-6）、丙氨酸基转移酶（alamine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS15.0统计学软件，其中计量资料以（x±s）表示，组间比较采用重复测量方差分析及SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝组织病理变化

SO组大体及镜下肝细胞形态无明显改变（封三图1）；SAP组6 h大体肝组织色泽变暗，12 h出现瘀血，24 h出现缺血坏死斑块，随时间延长范围逐渐扩大。镜下6 h出现炎症细胞聚集，12 h后出现肝细胞坏死和出血（封三图2）；ROSI组肝脏各时相点大体及镜下改变较SAP模型组有不同程度减轻（封三图3）。

2.2三组肝脏TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平比较

与SO组比较，SAP组造模后6 h肝组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达明显升高（P<0.01）。与SAP组比较，ROSI组TLR4、NF-κBp65蛋白表达显著降低（P<0.05），见表1。

2.3三组肝脏Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较

ROSI组肝组织Bax较SAP组减少，Bcl-2较SAP组上升（P<0.05），见表2。

2.4三组肝细胞凋亡指数比较

SAP组大鼠造模后凋亡指数明显升高，ROSI组凋亡指数较SAP组明显下降（P<0.05），见表3。

2.5三组血清炎症因子含量比较

SAP组各血清炎症细胞因子TNF-α，IL-1β、IL-6随时间延长逐渐升高。ROSI组与SAP组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

2.6 三组血清肝功能指标比较

SAP组血清肝酶指标含量随造模时间延长逐渐升高，ROSI组各指标含量较SAP组有不同程度下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

3 讨论

急性胰腺炎尤其是重症急性胰腺炎的发生发展与炎症细胞的过量产生有关，核因子κB便是调控MODS的中介之一。早在1998年，Jiang等[1]首次提出PPAR-γ可能通過抑制NF-κB调节炎症反应。PPAR-γ能促进炎症细胞增殖反应，具有很强的抗炎功能，能抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的产生及ICAM-1、NF-κB的表达。PPAR-γ抑制IκB降解后可有效降低NF-κB活性[4-8]。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）激动剂也是细胞炎症反应的调节剂，可通过抑制NF-κB调节炎症反应[5-8]。查阅国内外文献，有关急性胰腺炎（AP）与PPAR-γ激动剂之间的研究不少，但以研究15 d-PGJ2和罗格列酮关系较多，很多学者也通过实验证明PPAR-γ激动剂能在一定程度上减轻胰腺炎，特别是在预防和降低胰腺炎的外周并发症方面有一定作用。但查阅文献后我们发现研究NF-κB信号通路的文献报道较少[9-18]。

本實验通过对SAP大鼠静脉注射罗格列酮，观察其对大鼠肝细胞损伤、肝细胞凋亡、外周血炎症细胞因子的影响及NF-κB/TLR4信号传导通路作用。实验结果显示，ROSI组大鼠各时相肝脏病理损害最轻，外周血肝酶ALT、AST、LDH水平明显下降（P<0.05），表明罗格列酮对SAP肝损伤有保护作用。同时ROSI组肝细胞Bax较SAP组减低而Bcl-2上升（P<0.05），肝细胞凋亡指数较SAP组有明显下降（P<0.05），表明罗格列酮可能参与Bax/Bcl-2凋亡调节机制控制肝细胞凋亡。ROSI组大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α等含量下调（P<0.05），肝组织NF-κB、TLR4活性下降（P<0.05），表明罗格列酮可能通过抑制NF-κB/TLR4信号传导通路发挥效应，提示PPAR-γ激动剂抑制NF-κB/TLR4信号传导通路的活化，下调下游促炎细胞因子表达可能是胰腺炎治疗的新途径。

总之，PPAR-γ激动剂对急性胰腺炎有确定的治疗效果，其可能是通过对NF-κB/TLR4信号通路的选择性抑制，控制促炎因子释放，减轻炎症级联反应，保护胰外器官，已广泛投入临床应用治疗糖尿病，包括吡格列酮、罗格列酮等。上述噻唑烷二酮类药物对PPAR-γ选择性较高[19，20]，激活强度在毫微克量级，希望在不久的将来其独特又强大的控制炎症功效可以用于急性胰腺炎的早期治疗。

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（收稿日期：2016-08-18）