木薯eIF4E7基因RNAi载体构建及沉默效果分析

张秀春 武亚丹 张春微 王健华 余乃通 刘志昕

摘 要 由木薯褐色条斑病毒（Cassava brown steak virus，CBSV）和乌干达木薯褐色条斑病毒（Uganda Cassava brown steak virus，UCBSV）引起的木薯褐色条斑病毒病（CBSD）严重威胁着非洲木薯种植业的发展，且目前没有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻译和复制系统来完成基因组的翻译及自身的复制，其中真核翻译起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）是多种 RNA 病毒侵染植物的必需因子。eIF4E7是木薯编码的eIF4E基因家族成员之一，本研究构建该靶标基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E7。本生烟瞬时表达系统结合半定量RT-PCR的方法证明，该载体能高效沉默过量表达载体pAI-Ca4E7中的eIF4E7基因在本生烟叶片中的表达。研究结果为进一步研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用 RNA技术干扰植物基因的病毒防治新策略奠定基础。

关键词 木薯；eIF4E7；干扰载体；本生烟瞬时表达；半定量RT-PCR；沉默效果

中图分类号 S435.33 文献标识码 A

Abstract Cassava（Manihot esculenta Grantz）production in large areas of Africa is severely affected by cassava brown streak disease（CBSD）which is caused by two virus species， cassava brown streak virus（CBSV）and Ugandan cassava brown streak virus（UCBSV）. At present， there is no effective strategy for preventing CBSD. To complete the translation and replicaiton of its genome， virus need to employ the translation and replication system of host. During virus infection plants eukaryotic initiation factor 4E（eIF4E）has been implicated a necessary factor for a variety of RNA viruses. Cassava eIF4E7 is one member of Cassava eIF4E family. At present study we develop a interfering construct p1300-Ca4E7 which targetting Cassava eIF4E7 gene and demonstrate the construct can interfere the expression of eIF4E7 gene efficiently by employing the N. Banthemiana transient expression system and the semi-quantitative RT-PCR as well. The result pave a way for further investigating the function of Cassava eIF4E7 during the infecton of CBSV and UCBSV. It also provide theoretical basis for the new strategy of anti-virus by targeting host genes with RNAi technology.

Key words Cassava（Manihot esculenta Crantz）； eIF4E7； interference vecter； N. Banthemiana Transient Expression System； semi-quantitative RT-PCR； interference Efficiency

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.015

木薯褐色條斑病毒病（CBSD）在乌干达等国家发生严重危害，导致减产30%～85%，主要症状表现为叶片发黄、枝条的皮上有褐色坏死、老枝条上出现褐色条纹、块根褐色坏死。由于该病不仅导致减产，还使块根不适于食用，已被视为比木薯花叶病毒病危害更大的病害，是热带非洲粮食安全的主要威胁之一。CBSD是由属于Potyviridae科Ipomovirus属的木薯褐色条斑病毒（Cassava brown steak virus，CBSV）和乌干达木薯褐色条斑病毒（UCBSV）引起的，它们都是单组分正链RNA病毒，通过单一开放阅读框表达产生一种多肽前体，可翻译切割成10种成熟蛋白，自基因组5′起分别为P3、6K1、CI（helicase）、6K2、VPg、NIa-Pro、RdRp、CP、PIPO和P3[1]。

病毒由于拥有极小的基因组，需要借助植物的翻译和复制系统来完成基因组的翻译及自身的复制。植物寄主对病毒的敏感性取决于病毒蛋白与植物“易感基因”编码蛋白之间的密切相互作用。任何打破病毒与植物编码蛋白之间的相互作用都会导致寄主敏感性的丧失，从而对病毒感染产生抗性[2]。自然界中存在的隐性抗性基因，就是由于植物翻译和复制系统中相关蛋白因子的功能丧失或者以病毒不能识别的方式存在，病毒无法在寄主体内完成增殖，致使植株获得对病毒的抗性。马铃薯Y病毒（Potyviruses）的研究结果显示，大部分隐性抗病基因是转录起始因子（eIF4E）基因家族的等位基因。由于少数关键位点变异，病毒的基因组连接蛋白（VPg）无法识别并与其相互作用，导致病毒不能复制，从而对病毒产生免疫力。利用基因工程手段敲除或突变寄主eIF4E类因子可以使番茄、甜瓜等作物获得对CVYV、MNSV等马铃薯Y病毒的抗性[3-6]，也进一步证明寄主eIF4E类因子对马铃薯Y病毒侵染复制的重要性。

前期研究发现，木薯eIF4E7与CBSV及UCBSV的VPg蛋白均发生互作，说明它们很可能在CBSV及UCBSV侵染中起关键作用。RNA沉默又称RNA干扰（RNAi），是指在真核生物中，双链RNA专一的RNaseIII家族核酸内切酶——Dicer或Dicer-like（简称DCL）剪切双链RNA或部分双链发夹结构产生20 nt左右的siRNA（small interference RNA），然后形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，简称RISCs），利用RNA序列匹配，专一地识别靶标基因，在转录水平或转录后水平抑制靶标基因表达的现象[7]。本研究构建靶标木薯eIF4E7基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E7，并利用本生烟瞬时表达系统结合半定量RT-PCR证明该载体能有效地干扰木薯eIF4E7基因，为研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用及通过RNAi技术培育抗多个 CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品种）奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 RNAi克隆载体p18TRNAi和经改造后的植物表达载体pCAMBIA1300分别由中国热带农业科学院热带生物技术研究所于晓玲副研究員和阮孟斌副研究员提供。质粒pGBKT7-eIF4E7、pAI-ALSV、大肠杆菌DH5α菌株和农杆菌LBA4404由本实验室保存。

1.1.2 植物材料 本生烟（Nicotiana Banthemiana）由本实验室培养，以26～28 ℃光照培养，每日光照培养12 h，光照强度为1 500 lx。待植株长至5～6叶期时注射农杆菌。

1.1.3 酶与试剂 各种限制性内切酶、Prime STARR Max DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、PCR Mix均购自TaKaRa公司，Gibson AssemblyR Master Mix购自NEW ENGLAND BioLabs公司，TRIzolR Reagent、FastQuant RT Kit（with gDNase）购自TIANGEN生物技术公司，研究中所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 干扰片段的选择 登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E7基因（013732m，https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）进行分析，选取eIF4E7基因第340～656 bp为干扰片段，该区域包含软件分析的最有可能产生小RNA的前2个序列。

1.2.2 正反义干扰片段的扩增、连接、转化及重组子的PCR鉴定 根据从eIF4E7基因中所选取的干扰片段设计引物，引物设计如表1所示。为采用Gibson Assembly技术构建载体，引物前端添加拟连接载体序列（黑体加粗）。G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC用于扩增反义插入片段Ca4E7R，G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX用于扩增正义片段Ca4E7F。以pGBKT7-eIF4E7为模板，PCR扩增体系为：5 ng/μ DNA模板1 μL，PrimeSTARR Max Buffer 5 μL（10×），dNTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1 μL，PrimeSTARR HS DNA Polymerase 0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。扩增条件为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 8 s， 55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.3 利用Gibson Assembly技术构建RNAi克隆载体 利用Gibson Assembly技术将扩增片段Ca4E7R与经EcoRⅠ和ClaⅠ双酶切回收的p18TRNAi大片段连接，具体操作按NEW ENGLAND BioLabs公司Gibson AssemblyR Master Mix试剂盒说明书进行。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，鉴定引物为Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC；对PCR检测呈阳性的克隆提取质粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定后再进行测序鉴定，将鉴定正确的克隆载体命名为pRNAiCa4E7R。pRNAiCa4E7R经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后回收大片段，采用Gibson Assembly技术将大片段与用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX进行PCR扩增获得的产物Ca4E7F连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取质粒进行PCR鉴定，鉴定引物为G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX；用EcoRⅠ和BamHⅠ对PCR检测呈阳性的克隆进行酶切鉴定，最后进行测序鉴定。将鉴定正确、含发夹结构的克隆载体命名为pRNAiCa4E7。PCR扩增体系均为：稀释质粒1 μL，PCR Mix 15 μL（2×），上游和下游引物各0.6 μL，补ddH2O至总体积30 μL。PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃，30 s 56 ℃，30 s 72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.4 RNAi载体p1300-Ca4E7构建及农杆菌转化

将表达载体pCAMBIA1300与pRNAiCa4E7经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，分别回收大小片段进行连接，具体参照T4 DNA Ligase试剂说明书进行。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行菌液PCR，鉴定引物为G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX，反应条件同1.2.3；将经PCR检测呈阳性的克隆提取质粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定。采用热击法将p1300-Ca4E7转化农杆菌LBA4404，经PCR鉴定正确后用于本生烟瞬时表达。

1.2.5 过量表达载体pAI-Ca4E7的构建及农杆菌转化 以pGBKT7-eIF4E7为模板，G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX为引物扩增eIF4E7基因，采用Gibson Assembly的方法将扩增产物eIF4E7与经XbaⅠ和 XhoⅠ双酶切回收的pAI-ALSV大片段连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行菌液PCR，鉴定引物为G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX，反应条件同1.2.3；将PCR检测呈阳性的克隆提取质粒，用XbaⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，将鉴定正确的eIF4E7基因过量表达载体命名为pAI-Ca4E7；采用热击法将pAI-Ca4E7转化农杆菌LBA4404，经PCR鉴定正确后用于本生烟瞬时表达。

1.2.6 农杆菌介导的瞬时表达 将含有eIF4E7基因过量表达载体pAI-Ca4E7、RNAi载体p1300-Ca4E7或表达载体pCAMBIA1300的农杆菌放在YEB液体培养基（含卡那霉素、链霉素和利福平各50 μg/mL）中，以28 ℃、200 r/min震荡培养24 h；取50 μL菌液至5 mL上述YEB液体培养基进行过夜培养，离心收集菌体，用MMA溶液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和100 μmol/L AS）重悬菌体至OD600=1.0，静置诱导培养3 h后經注射接种至5～6叶期的本生烟叶片，每个处理重复接种10片叶；将注射后的植物于26～28 ℃中光照培养，每日光照培养12 h，光照强度为1 500 lx。

1.2.7 半定量RT-PCR检测沉默效果 （1）半定量引物合成。为检测RNAi载体的干扰效果，使用Primer Premier 5（version 5.00）软件设计木薯eIF4E7检测引物Ca4E7-265F和Ca4E7-669R；并选用本生烟肌动蛋白（Actin） mRNA为内标，设计引物NbACT-247F、NbACT-780R，用以消除不同样品间模板量的差异。具体引物序列见表1。

（2）半定量检测。分别在注射农杆菌后第4天（4dpi）、第5天（5dpi）和第6天（6dpi）收集本生烟叶片。为减少由于实验操作造成的样品误差，注射后的叶片只取半片，每10半片叶混在一起提取RNA并反转录合成cDNA。RNA的提取和反转录反应分别按TIANGEN生物技术公司的TRIzolR Reagent、FastQuant RT Kit（with gDNase）说明书进行。

将上述所得cDNA进行间隔3倍的梯度稀释，以NbACT-247F和NbACT-780R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：不同稀释浓度的cDNA 4 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，NbACT-247F和NbACT-780R各0.5 μL（10 μmol/L），补ddH2O至总体积25 μL。PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，31个循环；72 ℃ 10 min。

取与内标NbActin扩增大体一致的样品进行eIF4E7表达量分析，以Ca4E7-265F和Ca4E7-669R为引物，PCR扩增体系和条件均与内标相同。以上每个独立实验重复3次以上。

2 结果与分析

2.1 克隆载体pRNAiCa4E7R的构建

用引物G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC扩增反义插入片段Ca4E7R，获得大于250 bp（图1泳道1）的条带，扩增大小与预期结果一致。将目的片段过柱回收后与p18TRNAi经EcoRⅠ和ClaⅠ双酶切回收的大片段连接，构建含反义插入片段的克隆载体pRNAiCa4E7R。用引物G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC对pRNAiCa4E7R进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图1泳道2）与目的片段Ca4E7R大小一致。用EcoRⅠ和BamHⅠ对pRNAiCa4E7R进行双酶切鉴定，所得酶切片段比对照p18TRNAi小（图2泳道1），约为500 bp（图2泳道2），与预期大小一致；测序结果表明，克隆载体pRNAiCa4E7R的插入片段序列与网上公布的序列一致。以上鉴定结果表明，含反义插入片段的pRNAiCa4E7R克隆载体构建成功，可用于下一步实验。

2.2 克隆载体pRNAiCa4E7的构建

用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX扩增反义插入片段Ca4E7F，获得大于250 bp（图1泳道3）的条带，扩增大小与预期结果一致。将目的片段过柱回收后与pRNAiCa4E7R经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收的大片段连接，构建含正反义插入片段、形成发夹结构的克隆载体pRNAiCa4E7。用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX对pRNAiCa4E7进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图1泳道4）与目的片段Ca4E7F大小一致；用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定，获得与预期一致、大于500 bp的片段（图2泳道3）；测序结果表明，克隆载体pRNAiCa4E7的正义插入片段序列与网上公布的序列一致。以上鉴定结果表明，含正反义插入片段、发夹结构的克隆载体pRNAiCa4E7构建成功，可用于下一步实验。

2.3 RNAi载体p1300-Ca4E7构建及农杆菌转化

表达载体pCAMBIA1300与pRNAiCa4E7经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，分别回收大小片段进行连接、转化。含Kan抗性平板上的克隆用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图1泳道5）与目的片段Ca4E7F大小一致；待鉴定质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定，切下与克隆载体pRNAiCa4E7大小相同的片段（图2泳道4与泳道3），说明RNAi载体构建成功，命名为p1300-Ca4E7。采用液氮冷激法将p1300-Ca4E7转化至根癌农杆菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图1泳道6）与目的片段Ca4E7F（图1泳道3）大小一致，说明p1300-Ca4E7已被成功转入到农杆菌，形成工程菌，可用于本生烟瞬时表达。

2.4 过量表达载体pAI-Ca4E7构建及农杆菌转化

用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX对pAI-Ca4E7进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图3泳道2）与目的片段eIF4E7（图3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ对pAI-Ca4E7进行双酶切鉴定，切下的小片段与预期大小一致；由于插入基因ALSV内部有1个XbaⅠ位点，从载体pAI-ALSV切下2个小片段（图4泳道1与泳道2）。鉴定结果表明eIF4E7基因已插入到pAI表达载体，命名为pAI-Ca4E7；经测序验证可知过量表达载体pAI-Ca4E7构建成功。采用液氮冷激法将pAI-Ca4E7转化至根癌农杆菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图3泳道3）与目的片段eIF4E7（图3泳道1）大小一致，说明pAI-Ca4E7已成功转入到农杆菌，形成了工程菌，可用于本生烟瞬时表达。

2.5 半定量RT-PCR检测沉默效果

为检测RNAi载体的沉默效果，分别提取注射农杆菌后4dpi、5dpi和6dpi的本生烟叶片RNA进行半定量RT-PCR检测。结果如图5所示，在采用本生烟NbActin基因为内标调整样品cDNA浓度基本一致的情况下（图5），注射农杆菌后4dpi，单独注射过量表达载体pAI-Ca4E7或与表达载体pCAMBIA1300共同注射的样品表达量基本一致，而单独注射农杆菌的样品检测不到木薯eIF4E7基因的表达，说明木薯eIF4E7基因在注射后4dpi能在本生烟中高效瞬时表达。但是，过量表达载体pAI-Ca4E7与干扰载体p1300-Ca4E7共同注射的样品只检测到微量的木薯eIF4E7基因表达。注射后5dpi、6dpi的表达情况与注射后4dpi的基本相同。由于干扰载体p1300-Ca4E7与表达载体pCAMBIA1300的大片段是相同的，区别仅在于干扰载体p1300-Ca4E7含有木薯eIF4E7基因部分片段的发夹结构，而表达载体pCAMBIA1300的插入片段为sGFP，说明木薯eIF4E7基因的表达量减少是由干扰载体的发夹结构引发的基因沉默造成的，所构建的木薯eIF4E7基因RNA干扰载体在体外能有效干扰靶标基因。此外，注射后6dpi过量表达载体pAI-Ca4E7不论单独注射还是與表达载体pCAMBIA1300共同注射，木薯eIF4E7基因的表达量均有所降低，说明这是由于植物自身的RNAi效果引发的。

3 讨论

隐性抗病基因在植物抗病毒中是普遍存在的，目前已有很多实例显示隐性抗病基因能够控制重要的农业病毒，尤其是对马铃薯Y病毒属病毒，其隐性抗病基因占抗性基因的40%。目前发现的隐性抗病基因有mo1（莴苣）、nsv（甜瓜）、pot-1（野生马铃薯）、pvr1、pvr2、pvr6和pvr2（辣椒）、rym4、rym5和rym6（大麦）、sbm1、wlv和cyv2（豌豆）、va1和va2（烟草）、Isp1-1、Isp1-2和 Isp1-3（拟南芥），tsv1和rymv-1（水稻）等，分别对不同种病毒产生抗性，研究证明这些抗病毒基因大部分是eIF4E家族等位基因，它们之间仅少数位点有差异[8-9]。

前期研究发现木薯编码的eIF4E基因家族成员013732m（本文中命名为eIF4E7）与CBSV及UCBSV的VPg蛋白的均发生互作（实验数据尚未发表），说明它们很可能在CBSV及UCBSV侵染中起关键作用。为深入研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及通过RNAi技术培育获得抗多个CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品种），本研究构建靶标木薯eIF4E7基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E7，并利用本生烟瞬时表达系统结合半定量RT-PCR对其干扰效果进行研究。

由于木薯转化工作不仅耗时长，而且难度比较大[10]，因此很有必要在用于转化木薯之前鉴定所构建的RNAi载体是否能有效地沉默靶标基因。为检测干扰载体p1300-Ca4E7的沉默效果，本研究采用本生烟瞬时表达结合半定量RT-PCR的方法，构建了木薯eIF4E7基因的过量表达载体pAI-Ca4E7，并利用农杆菌注射法将其单独或与干扰载体p1300-Ca4E7一起转入本生烟叶片中表达。半定量RT-PCR分析表明注射后第4天表达载体pAI-Ca4E7能在本生烟叶片中高效表达eIF4E7基因，但将pAI-Ca4E7与干扰载体p1300-Ca4E7一起注射后eIF4E7基因的表达量明显降低，说明构建的木薯eIF4E7基因RNA干扰载体能有效沉默靶标基因。与文献报道的方法（利用转化体系成熟的植物如拟南芥[11]、烟草[12]、水稻[13]等，或导入原生质体后再进行RT-PCR检测[14]）比较，本研究采用的RNAi载体沉默效果检测方法具有简单、快捷、灵敏等特点。注射农杆菌后第4天便可进行检测，而转化体系成熟的模式植物获得转基因植物至少也需要3个月的时间；利用原生质体时间虽然相对短，但原生质体的制备还是比较困难。本研究构建高效沉默该基因的RNAi载体，为研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用及通过RNAi技术培育获得抗多个CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品种）奠定基础。

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