甘露醇胁迫下模式植物狗尾草种子萌发期抗旱性鉴定与评价指标研究

赵辉 张丽丽 郭静远 霍姗姗 贺萍萍 夏启玉 符冬妹 郭安平

摘 要 狗尾草是一種新型的模式植物，符合作为模式植物的所有要求，是C4光合作用的优秀模型，也是研究非生物胁迫耐受性很好的模型。在狗尾草高效遗传转化技术的基础上，以适宜转化的狗尾草ME34品系非转基因成熟种子为外植体，根据甘露醇高渗培养基培养法，设计了0、200、300、400、500、600 mmol/L 6个梯度，对狗尾草ME34品系种子萌发期的抗旱性进行了鉴定。结果表明：甘露醇200～300 mmol/L的梯度是鉴定狗尾草ME34品系抗旱性的关键梯度，种子萌发期发芽率、鲜重、根长、芽长等各项生长指标都受到显著或极显著的影响，各生长指标对甘露醇干旱胁迫的敏感性依次为鲜重>根长>芽长>发芽率，参数间两两显著或极显著正相关；鲜重对甘露醇的胁迫的反应最敏感和直接，在200 mmol/L梯度下已表现为极显著降低，可作为该品系种子萌发期抗旱性鉴定的一级指标；根长对甘露醇梯度的反应是低浓度促进根的生长，高浓度抑制根的生长，极显著促进生长的梯度（200 mmol/L）适合用作鉴定依据，此外，芽长对甘露醇也敏感，200、300 mmol/L分别显著和极显著抑制芽长，根长和芽长可作为该品系种子萌发期抗旱性鉴定的二级指标；种子发芽率对甘露醇的敏感性稍弱，200 mmol/L条件下发芽率变化不明显，在300 mmol/L条件下才表现为极显著下降，可作为该品系种子萌发期抗旱性鉴定的三级指标。实验为狗尾草作为抗旱模式植物的研究准备了抗旱性评价指标基础，无论是外源抗旱基因在狗尾草内的过表达，还是内源抗旱基因的敲除，都需要这些具体评价指标的支撑。

关键词 狗尾草；萌发期；抗旱性鉴定；甘露醇

中图分类号 S544.3 文献标识码 A

Abstract Setaria viridis was a new model plant， which meets all the requirements of model plants. It was an excellent model of C4 photosynthesis， and for studying the tolerance of abiotic stress. Based on the efficient genetic transformation of Setaria viridis， the non-transgenic mature seeds of ME34 strain which was Setaria viridis suitable for transformation were choosen as explants to study drought tolerance. According to Mannitol medium culture method，0， 200， 300， 400， 500， 600 mmol/L 6 gradients were designed. The germination rate，bud length，root length and fresh weight of each gradient were measured and analyzed. The results showed that the 200-300 mmol/L gradient of Mannitol were the key gradients of the Mannitol tolerance for ME34 strain. The germination rate，fresh weight，root length and bud length of seed germination were significant or extremely significant affected. The susceptibility of each growth index to mannitol drought stress was fresh weight>root length>bud length>germination rate. There were significant or extremely significant correlations between the four parameters. The fresh weight was the most sensitive and direct to the mannitol stress and extremely significant reduced at 200 mmol/L gradient，which could be used as the first grade index for drought resistance identification at seed germination stage. The sensitivity of the root length to mannitol stress was also very strong，but as a drought resistance index，only the extremely significant gradient（200 mmol/L）was suitable for identification. In addition，bud length was also sensitive to mannitol，200， 300 mmol/L，was the significant and extremely significant reduced gradient，respectively. Root length and bud length could be used as the second grade index for drought resistance identification at seed germination stage. The seed germination rate was not significant at 200 mmol/L，and it showed a extremely significant decrease under the condition of 300 mmol/L. Compared with other growth indexes，the susceptibility was weak， which could be used as the third grade of drought resistance identification index. The study prepared the identification and evaluation index of drought tolerance at seed germination stage for the pattern plant of Setaria viridis under Mannitol Stress. Whether the overexpression of exogenous drought-resistant genes of Setaria viridis，or the knockout of endogenous anti-drought gene，both need the support of these specific evaluation indicators.

Key words Setaria viridis； germination stage； identification of drought tolerance； mannitol

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.011

狗尾草（Setaria viridis）起源于热带，属单子叶植物纲禾本科黍亚科，该科植物具有熱带植物的典型特征。狗尾草与谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草类亲缘关系接近，具有C4光合作用系统，在国际上主要作为C4光合作用的优秀模型。此外，狗尾草本身耐热、耐旱、耐盐，是研究非生物胁迫耐受性很好的模型；狗尾草是新型的转基因模式植物，与双子叶模式植物拟南芥相比具有生长周期短、植株矮小、易于种植、容易转化、基因组小、呈二倍体、能产生大量自交系种子等优点，是优良的单子叶模式植物[1-10]，几乎符合作为一种模式植物的所有要求。

在拟南芥模式植物实际应用中科学家们发现，由于许多粮食作物为禾本科、单子叶植物，而拟南芥为双子叶植物，较远的亲缘关系，导致同家族基因的功能出现严重分化，致基因功能完全相反。因此，拟南芥中基因功能的研究，离其在最终农作物中的应用还很远[11-12]。于是，科学家们又发展了水稻作为禾本科的模式生物，由于其基因组小，易于转化等诸多优点，以水稻为模式植物开展的研究也越来越多，尤其是中国在水稻的功能基因组学方面的研究已经走在世界的前列。但是，水稻作为模式植物有先天的缺点，它对生长对环境的要求比较严格，在北方每年只能种一季。

狗尾草在研究C4植物的光合作用机理和非生物胁迫耐受性方面，具有得天独厚的优势，与许多禾本科农作物如谷子、玉米等具有较近的亲缘关系，它们的基因功能更具有较高的保守性。Huang等[13]以狗尾草为模式植物，通过NMU诱变，筛选到了一个花絮稀疏的突变体，通过BSA重测序方法，鉴定到了突变基因，而且玉米中的同源基因突变后也表现出与狗尾草突变体相同的表型，这进一步证明了以狗尾草为模式植物进行玉米基因组功能研究的优越性。

干旱是一种世界性的灾害，因干旱而引起的粮食减产比其它所有逆境因素所导致的减产总和还要多。 据统计，世界上干旱及半干旱地区约占地球陆地面积的34.9%，中国干旱、半干旱地区占国土面积的47%，占总耕地面积的51%，干旱缺水是中国农业面临的最严重的问题之一[14-17]。因此，作为模式植物的狗尾草，在高效遗传转化技术的基础上开展的抗旱基因功能研究在中国必将具有更重要的意义，但国内外将狗尾草作为抗旱转基因育种模式植物的研究还很少。本研究在狗尾草高效遗传转化技术的基础上，以适宜转化的狗尾草ME34品系非转基因种子为外植体，根据甘露醇高渗培养基培养法，设计了0、200、300、400、500、600 mmol/L 6个梯度，对狗尾草ME34品系种子萌发期的抗旱性进行了鉴定，为狗尾草作为抗旱转基因育种模式植物的抗旱性评价指标的鉴定打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以适宜遗传转化的狗尾草ME34品系为植物材料，材料由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell 实验室提供，以ME34品系经休眠处理的成熟种子为外植体材料，研究种子萌发期的抗旱性。

1.2 方法

1.2.1 相关组培技术 甘露醇高渗培养基配制：1/2MS培养基，10 g蔗糖，pH5.8，Gelzan植物凝胶4 g，在基础培养基内分别添加甘露醇，添加浓度梯度为0、200、300、400、500、600 mmol/L，于120 ℃高压灭菌20 min后倒皿备用。

种子的无菌处理和接种：选取经休眠处理的狗尾草干燥成熟种子，去除种皮后将约1 g种子装入14 mL离心管，加入10 mL有效浓度约1%～3%的次氯酸钠溶液，再加50 μL吐温20溶液，灭菌消毒处理约10 min；用无菌水清洗多次后，将种子接种于含不同浓度梯度的甘露醇的高渗培养基上，种子的芽朝上，每皿培养基约接20粒种子，每个梯度接3皿（3个重复），于24 ℃光/暗培养（12 000 lx，16 h/8 h，50%～60%湿度），7 d以后观察记录各生长指标。

1.2.2 调查项目及分析方法

发芽率=发芽种子数/接种的种子数×100%。

芽长平均值=同一胁迫梯度下发芽种子苗地上芽长的均值。

根长平均值=同一胁迫梯度下发芽种子苗地下主根长的均值。

相对发芽率=胁迫处理的发芽率/对照处理的发芽率×100%。

芽生长抑制率=（对照芽长的均值-胁迫处理芽长的均值）/对照芽长的均值×100%。

根生长抑制率=（对照根长的均值-胁迫处理根长的均值）/对照根长的均值×100%。

鲜重抑制率=（对照鲜重的均值-胁迫处理鲜重的均值）/对照鲜重的均值×100%。

1.3 数据分析

数据、图标处理采用Excel 2010软件完成， 利用Sigma Plot 10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 甘露醇对狗尾草种子萌发的整体影响

从图1可知，与无甘露醇的对照相比，从种子萌发第7天的整个生长情况看，200 mmol/L甘露醇已经开始抑制狗尾草生长量（B），300 mmol/L表现出非常明显的抑制作用（C），B、C、D、E、F中狗尾草中的生长受抑制情况依次加重，400 mmol/L以上非转基因的ME34种子已很难生长（D）。根据测算，表1具体列出了各生长指标数据。

2.2 甘露醇对狗尾草种子发芽率的影响

图2是发芽率随甘露醇浓度梯度的变化图。从图中可知，发芽率随着甘露醇浓度的提高总体呈下降趋势，在0～300 mmol/L的范围内发芽率下降较快，300～400 mmol/L的范围内变化平缓，400～600 mmol/L范围内再次急速下降。此外，从各梯度发芽率方差分析可知，0 mmol/L与200 mmol/L的发芽率差异不显著（p=0.095>0.05），与300～600 mmol/L差异极显著（p=0.000 54，0.000 79，0.000 24， 1.17E-05<0.01）；200 mmol/L與300～600 mmol/L差异极显著（p=1.41E-05，8.03E-05，7.37E-05，8.42E-08<0.01）；300 mmol/L与400 mmol/L差异不显著（p=0.4625>0.05），与500～600 mmol/L差异极显著（p=0.003 3，2.47E-06<0.01）；400 mmol/L与500～600 mmol/L差异极显著（p=0.0032，6.1521E-06<0.01）；500 mmol/L与600 mmol/L差异极显著（p=0.0002<0.01）。从各梯度变化图和方差分析的整体情况看，200 mmol/L对发芽率影响不显著，300 mmol/L极显著影响发芽率，如果需要通过发芽率考察ME34品系转基因后的抗旱能力，需要用到300 mmol/L的梯度。

2.3 甘露醇对狗尾草种子萌发期鲜重的影响

图3是鲜重随甘露醇浓度梯度的变化图。从图3可知，鲜重随着甘露醇浓度的提高总体呈下降趋势，在0～200 mmol/L的范围内鲜重下降明显，200～600 mmol/L范围内鲜重下降平缓。此外，从各梯度鲜重方差分析可知，0 mmol/L与200、300、400、500、600 mmol/L的鲜重差异极显著（p=0.006 2， 0.002 3，0.001 8，0.001 4，0.000 8<0.01）；200 mmol/L与300、400 mmol/L差异不显著（p=0.124 6， 0.051 8>0.05），与500 mmol/L差异显著（p=0.021 1 <0.05），与600 mmol/L差异极显著（p=0.003 6<0.01）；300 mmol/L与400 mmol/L差异不显著（p=0.226 7>0.05），与500 mmol/L差异显著（p=0.042 2 <0.05），与600 mmol/L差异极显著（p=0.001 3<0.01）；400 mmol/L与500 mmol/L差异不显著（p=0.202 5>0.05），与600 mmol/L差异极显著（p=0.005 2 <0.01）；500 mmol/L与600 mmol/L差异显著（p=0.031 3<0.05）。从各梯度变化图和方差分析的整体情况看，200 mmol/L极显著影响鲜重，如果需要通过鲜重考察ME34品系转基因后的抗旱能力，需要用到200 mmol/L的梯度。

2.4 甘露醇对狗尾草种子胚芽生长的影响

图4是芽长随甘露醇浓度梯度的变化图。从图中可知，芽长随着甘露醇浓度的提高总体呈缩短趋势，在0～300 mmol/L的范围内芽长下降明显，300～600 mmol/L范围内芽长下降平缓。此外，从各梯度芽长方差分析可知：0 mmol/L与200 mmol/L的芽长差异显著（p=0.017 9<0.05），与300～600 mmol/L差异极显著（p=0.000 8，0.000 4，0.000 3， 0.000 2<0.01）；200 mmol/L与300～600 mmol/L差异极显著（p=0.002 8，0.001 0，0.000 4，0.000 2<0.01）；300 mmol/L与400 mmol/L差异显著（p=0.026 1<0.05），与500～600 mmol/L差异极显著（p=0.002 7，0.000 5<0.01）；400 mmol/L与500 mmol/L差异显著（p=0.046 1<0.05），与600 mmol/L差异极显著（p=0.002 5<0.01）；500 mmol/L与600 mmol/L差异显著（p=0.012 9<0.05）。从各梯度变化图和方差分析的整体情况看，200 mmol/L显著影响芽长，300 mmol/L极显著影响芽长。如果需要通过芽长考察ME34品系转基因后的抗旱能力，需要用到200 mmol/L和300 mmol/L的梯度。

2.5 甘露醇对狗尾草种子胚根生长的影响

图5是根长随甘露醇浓度梯度的变化图。从图中可知，根长的变化与发芽率、鲜重、芽长的变化有所不同，随着甘露醇浓度的提高总的趋势是先升高后降低，在0～300 mmol/L的范围内根长有先显著升高后下降的趋势，300～600 mmol/L范围内根长一直下降。此外，从各梯度根长方差分析可知，0 mmol/L与200 mmol/L的根长差异显著（p=0.012 7<0.05），与300 mmol/L差异不显著（p=0.383 8>0.05），与400 mmol/L差异显著（p=0.032 6<0.05），与500～600 mmol/L差异极显著（p=0.004 5，0.000 3<0.01）；200 mmol/L与300～600 mmol/L差异极显著（p=0.006 1， 0.001 1，0.000 4，7.19E-05<0.01）；300 mmol/L与400 mmol/L差异不显著（p=0.1140>0.05），与500～600 mmol/L差异极显著（p=0.009 8，0.000 4<0.01）；400 mmol/L与500 mmol/L差异显著（p=0.011 9<0.05），与600 mmol/L差异极显著（p=5.85E-05<0.01）；500 mmol/L与600 mmol/L差异极显著（p=0.000 4<0.01）。从各梯度变化图和方差分析的整体情况看，根长随着甘露醇胁迫浓度的增加有先增长后缩短的趋势，在200 mmol/L梯度下根长极显著增长。如果考察ME34品系转基因后的抗旱能力，200 mmol/L梯度下根长的增长量可以用来鉴定抗旱性的强弱；由于0 mmol/L与300 mmol/L差异不显著，同时，300 mmol/L的梯度下非转基因ME34品系的总体生长量已经很小，所以300 mmol/L以上的梯度不适合用来从根长的角度进行转基因狗尾草抗旱鉴定。

2.6 甘露醇胁迫下狗尾草种子萌发期各生长指标的相关性分析

甘露醇胁迫下狗尾草ME34品系种子萌发期各生长指标的相关性见表2。其中，发芽率与根长、芽长、鲜重呈极显著正相关；根长与芽长呈极显著正相关，根长与鲜重呈显著正相关；芽长与鲜重呈极显著正相关。

3 讨论

从狗尾草的起源、分布和生存环境可知，狗尾草具有丰富的抗性基因资源，狗尾草是谷子（Setaria italica）的野缘近亲，有研究表明谷子的很多栽培品系明显抗旱，1 g的干物质产量，玉米需要470 g水，小麦需要510 g水，谷子只需要257 g水[18-19]。狗尾草是比拟南芥更贴近主要农作物的模式植物，目前针对狗尾草的研究主要还在C4机理方面，针对其抗旱性开展的研究还很少，有很大的研究空间[11-13]。狗尾草的抗旱机理涉及代谢、蛋白水解和信号传递等各种机制[20-21]。在狗尾草高效遗传转化技术的基础上，以狗尾草为模式植物，通过转基因技术的过表达或基因编辑等技术对狗尾草的抗旱机理进行研究，必将取得丰硕的研究成果，并指导作物育种工作。

植物的抗旱性是一个极其复杂的数量性状，针对模式植物狗尾草尚无一个简单有效、经济方便、实用可靠、便于实验室参考使用的抗旱性鉴定指标体系。本研究在参考玉米、大豆、水稻等大宗作物抗旱性鉴定方法的基础上，选择甘露醇高渗培养基培养法，在组织培养条件下，对狗尾草ME34品系種子萌发期的抗旱性进行了鉴定，为模式植物狗尾草抗旱转基因研究提供了抗旱性鉴定指标体系。

实验结果表明，甘露醇200～300 mmol/L梯度是鉴定狗尾草ME34品系抗旱性的关键梯度，种子萌发期发芽率、鲜重、根长、芽长等各项生长指标都受到显著或极显著的影响。其中鲜重对甘露醇的胁迫最敏感，在200 mmol/L梯度下已表现出极显著降低趋势，可作为该品系种子萌发期抗旱性鉴定的一级指标；根长对甘露醇胁迫的敏感性也很强，在200 mmol/L梯度下根长极显著增加，但根长对甘露醇梯度的反应是低浓度促进根的生长，高浓度抑制根的生长，在高浓度抑制的条件下种子已难以萌发生长，所以作为抗旱指标，极显著促进生长的梯度（200 mmol/L）适合用作鉴定依据；此外，芽长对甘露醇也敏感，200、300 mmol/L分别显著和极显著抑制芽长，根长和芽长可作为该品系种子萌发期抗旱性鉴定的二级指标；种子发芽率在200 mmol/L条件下变化不明显，在300 mmol/L条件下才表现出极显著下降趋势，相对其它的生长指标，其敏感性稍弱，可作为该品系种子萌发期抗旱性鉴定的三级指标。

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