黔产野生水芹水溶性总黄酮纯化工艺

陈晓靓 郭晓青 罗显华 吴娜怡郁 代甜甜

摘要[目的]考察大孔树脂对黔产野生水芹（简称水芹）水溶性总黄酮的纯化条件。[方法]测定 AB-8、DM-130和HP-20 3种大孔树脂对水芹总黄酮的吸附量及解吸率，筛选树脂型号；以总黄酮含量为指标，采用单因素试验优选HP-20树脂纯化工艺。[结果]HP-20型大孔树脂分离纯化水芹总黄酮最佳的工艺条件为：料液比为1∶30（g∶ mL），静置吸附时间为6 h，解吸液乙醇溶液的体积分数为70%，pH为3，解吸温度为40 ℃，经HP-20处理后的水芹总黄酮纯度较高（提高了9.4倍）。[结论]HP-20树脂较适于分离纯化黔产野生水芹水溶性总黄酮，为水芹的开发利用提供科学依据。

关键词黔产野生水芹；大孔树脂；静态吸附；总黄酮类；纯化工艺

中图分类号S647；R284.2文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）12-0106-04

Abstract[Objective] The research aimed to study the purification conditions of watersoluble total flavonoids from wild Oenanthe javanica in Guizhou Province.[Method]The adsorption quantity and desorption rate of three kinds of macroporous resins （AB-8、DM-130 and HP-20） were measured for total flavonoids of Oenanthe javanica，resin type was selected.Using the content of total flavonoids as index，the single factor experiment was used to optimize the purification process of HP-20 resin.[Result]The optimum process conditions of separation and purification of total flavonoids from Oenanthe javanica for HP-20 macroporous resin：solidliquid ratio was 1∶30 （g∶ mL），standing time was 6 h，the volume fraction of the desorption ethanol solution was 70%，pH value of sample was 3，the desorption temperature was 40 ℃。The total flavonoids had high purity after HP-20 macroporous resin （increased 9.4 times）.[Conclusion]HP-20 resin is suitable for separation and purification of watersoluble total flavonoids，to provide a scientific basis for the development and utilization of Oenanthe javanica.

Key wordsWild Oenanthe javanica in Guizhou Province；Macroporous resin；Static adsorption；Total flavonoids；Purification process

黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如使血管的渗透压保持正常、降低血管脆性、降低人体胆固醇含量、抗过敏、降血压、抑制癌变和糖病毒作用等[1-5]，在医药食品等领域具有广阔的应用前景，近年来成为国内外诸多学者研究开发和利用的热点。因此，有效地分离提纯黔产野生水芹中总黄酮类物质对开发中药新药和充分利用我国中草药资源具有重要意义。

大孔吸附树脂是一类有机高分子聚合物吸附剂，具有容量大、吸附速度快、选择性好、再生渐变等优点，因而被广泛用于天然产物的分离纯化，是提取分离中草药有效成分的一种有效方法[6-9]。目前水芹总黄酮的提取工艺已有报道[10]，但利用大孔树脂分离提纯水芹中水溶性总黄酮鲜见报道。水芹水溶性总黄酮含量较高，作为药食兼用的食物，以水提取总黄酮食用性较强，因此为了更合理地开发利用黔产野生水芹资源，该研究以水芹水溶性总黄酮含量为考察目标，选用大孔树脂分离纯化水芹水溶性总黄酮，采用静态试验考察大孔树脂对水芹总黄酮分离纯化工艺条件及效果，研究分離纯化水芹总黄酮的最佳工艺条件及各种影响因素，从而为生产中最有效开发利用黔产野生水芹提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料。野生水芹采自贵州省贵阳周边，将样品用去离子水清洗干净，沥干表面水分，置恒温干燥箱中60 ℃干燥至恒重，粉碎后过15 μm的筛，密封保存待用。

1.1.2试剂。大孔树脂AB-8、DM-130和HP-20，其他试剂均为分析纯。

1.1.3仪器与设备。FA 1604A 型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；TU-1810型紫外可见分光光度计 （北京市普析通用仪器有限责任公司）；WGL-45B型真空干燥箱（天津市邰思婷仪器有限公司）；SHA-2型制冷水浴恒温振荡器（金坛市医疗仪器厂）；ZN-500微型高速粉碎机（长沙市中南制药机械厂）。

1.2方法

1.2.1水溶性总黄酮含量的测定。

1.2.1.1黄酮类化合物的显色反应。

黄酮类化合物分子中存在酚羟基和苯并吡喃酮环，根据还原试验（NaBH4）、金属盐类试剂的络合反应（镁盐）、硼酸显色反应和碱性显色反应等一系列的显色反应[11]，检验各类黄酮类化合物类型。通过显色反应（表1），表明黔产野生水芹中含有二氢黄酮（醇）类、异黄酮类、5-羟基黄酮、2-羟基查耳酮以及黄酮醇类等物质。这些多羟基黄酮类物质在水中溶解度较高，易形成糖苷类物质，使水芹的水溶性总黄酮更具实用价值。

1.2.1.2标准曲线的绘制。

根据参考文献[12-14]采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定水芹中总黄酮含量，并得出标准曲线的回归方程：A=6.1848 C-0.004 3（R2=0.996 3），式中，C为芦丁质量浓度（mg/mL），A为吸光度。

1.2.1.3水溶性总黄酮粗提液的制备。取黔产野生水芹干粉2 g，按料液比1∶40（g∶mL）的比例与去离子水混合，搅拌均匀，采用90 ℃水浴加热浸提，浸提时间20 min。浸提液冷却至室温后8 000 r/min离心10 min，上清液用100 mL容量瓶定容，得到水芹水溶性总黄酮待测液。

1.2.1.4总黄酮含量的测定。

取1 mL待测液，按“1.2.1.2”方法测定吸光度，根据式（1）求出样品液中总黄酮含量。

式中，C为总黄酮质量浓度（mg/mL），由标准曲线吸光度换算而得； V为样品液体积（mL）；W样为样品质量（g）。经计算，水芹水溶性总黄酮粗提液中总黄酮含量为1.28 mg/g。

1.2.2大孔树脂的预处理及筛选。

根据参考文献[15]的方法，对AB-8、DM-130和HP-20 3种大孔树脂进行预处理。以大孔树脂对水芹总黄酮吸附量[计算方法为式（2）和式（3）]和解吸率[计算方法为式（4）]为指标，比较AB-8、DM-130和HP-20 3种大孔树脂的吸附性能。

式中，Q为吸附量（mg/g）；C0为初始质量浓度（mg/mL）；C1为平衡质量浓度（mg/mL）；C2为解吸液质量浓度（mg/mL）；V为吸附液体积（mL）；W为树脂质量（g）。

1.2.3HP-20大孔树脂的静态吸附单因素试验。

1.2.3.1吸附料液比。准确称取处理好的HP-20树脂2 g，共4份，置于100 mL锥形瓶中，分别加入黔产野生水芹提取液20、40、60和80 mL，使树脂质量与样液体积的比值为1∶10、1∶20、1∶30和1∶40（g∶mL）。置于室温下，振荡吸附8 h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按式（2）计算树脂吸附量。

1.2.3.2吸附时间。准确称取处理好的HP-20树脂2 g，共4份，置于100 mL锥形瓶中，加入黔产野生水芹提取液60 mL。置于室温下，分别振荡吸附4、6、8和10 h，预使其达到最佳吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按式（2）计算树脂吸附量。

1.2.3.3乙醇洗脱体积分数。根据最佳吸附条件，称取2 g HP-20树脂4份，对水芹总黄酮物质进行吸附。吸附结束后，分别用40 mL体积分数为30%、50%、70%和90%的乙醇溶液置于室温下对吸附于HP-20树脂上的黄酮类物质进行解吸1 h。测定解吸液中黄酮类物质的含量，根据式（4）计算解吸率，以此选择最佳的乙醇解吸液体积分数。

1.2.3.4pH。同“1.2.3.3”先进行吸附。吸附结束后用40 mL 体积分数为70%的乙醇溶液对吸附于HP-20树脂上的黄酮类物质进行解吸。调节解吸液的pH，测定pH分别为2、3、5和7时解吸液中黄酮类物质的含量，根据式（4）计算解吸率，选择最佳的pH。

1.2.3.5解析温度。

同“1.2.3.3”先进行吸附。吸附结束后用40 mL体积分数为70%的乙醇溶液、调节解吸液的pH为3，分别置于20、40、60和80 ℃条件下对吸附于树脂上的黄酮类物质进行解吸，测定解吸液中黄酮类物质的含量，根据式（4）计算解吸率，选择最佳解吸温度。

2结果与分析

2.13种大孔树脂对水芹总黄酮吸附性能的影响

黄酮类化合物是一类其骨架具有15个碳原子的化合物，骨架中含有2个苯环，2个苯环由一个C3部分桥联，具有弱极性。因此，根据相似相容原理[16-19]，选取对分离黄酮类化合物作用较好的3种非极性树脂AB-8、DM-130和HP-20来考察对黔产野生水芹黄酮的吸附能力。结果表明（表2），非极性树脂HP-20对水芹的吸附量和解吸率均优于树脂AB-8和DM-130，因此，树脂AB-8和DM-130不适用于黔产野生水芹黄酮的吸附和解吸，在此采用树脂HP-20对水芹提取液中的总黄酮物质进行静态单因素试验考察。

2.2HP-20樹脂对黔产野生水芹提取液中黄酮类物质的静态吸附单因素试验

2.2.1吸附料液比对HP-20树脂静态吸附的影响。

由图1可知，当HP-20树脂的质量为2 g、水芹提取液体积为60 mL（料液比为1∶30）时，HP-20树脂的吸附效果最好，达38.16 mg/g。当料液比为1∶10或1∶20时，HP-20树脂对水芹中黄酮类物质的吸附量都不太理想，可能是由于料液比较小时，在试验时间内树脂吸附未达到饱和；相反料液比达1∶40时，HP-20树脂的吸附量反而减小，可能是因为大孔树脂进行了选择性吸附。

2.2.2吸附时间对HP-20树脂静态吸附作用的影响。

由图2可知，其他条件不变的情况下（料液比为1∶30，室温），HP-20树脂对水芹总黄酮的吸附量随着时间的加长而增大，当吸附时间为6 h时，吸附量达44.01 mg/g，较4 h吸附量增加了2倍多，但随着时间的加长，吸附量变化并不明显。因此，选择吸附时间6 h为最佳的静态吸附时间。

2.2.3乙醇洗脱体积分数对HP-20树脂静态解吸作用的影响。

从图3可以看出，当乙醇体积分数为30%时，解吸率仅为22.28%，随着乙醇体积分数的增加，当体积分数为70%时解吸率达51.43%，虽然随着体积分数的增加，解吸率仍然增大，但不明显。综合考虑回收率和后期生产成本，选择体积分数为70%的乙醇溶液作为HP-20树脂解吸液为宜。

2.2.4pH 对HP-20树脂静态解吸作用的影响。

由图4可知，随着pH的降低，解吸率逐渐增大。当pH为3时，解吸率为68.73%，pH为2时，解吸率为69.01%，但如果pH过低，即解吸液酸性太强，可能会对黄酮苷类物质的性质产生影响，如发生酸水解等。因此，选择解吸液最适pH为3。

2.2.5解析温度对HP-20树脂静态解吸作用的影响。

由图5可知，在乙醇体积分数和pH最优的情况下，使树脂解吸温度处于40 ℃时解吸率达到最大，为77.73%，随着温度的升高，解吸率反而降低了，可能因为温度过高，促使黄酮类物质的水解。因此，综合因素选择40 ℃为最佳解吸温度。

2.3水芹水溶性总黄酮提纯产物分析

在最佳提纯工艺条件下制备水芹水溶性总黄酮提纯产物，按照式（1）求出总黄酮含量，计算提纯产物后的样品中总黄酮含量为12.03 mg/g，比水芹干粉的含量（1.28 mg/g）提高了约9.4倍。

3结论

该研究通过对3种不同型号的大孔树脂进行了静态吸附-解吸吸附的筛选，发现HP-20型树脂对黔产野生水芹中总黄酮的吸附和解吸效果最好，因此采用HP-20型树脂对黔产野生水芹水溶性总黄酮进行纯化，并进一步对纯化工艺条件进行优化，最佳纯化工艺条件为：HP-20型树脂与粗提液比例为1∶30（g∶mL），静置吸附时间为6 h，吸附量最大达44.01 mg/g；用70%乙醇溶液在pH为3，40 ℃的条件下进行解析，解吸率最大为77.73%。在最佳的提纯工艺条件下制备的产物中总黄酮含量提高了9.4倍，说明提纯效果较好。

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