抗水稻细菌性条斑病芽孢杆菌菌株的选育

吴建飞 张金龙 田迪 朱金梅 张溢峰 白先放

摘要[目的]分离筛选得到抗水稻细菌性条斑病芽孢杆菌菌株，并进行鉴定，最后优化其产芽孢发酵条件。[方法]采用牛津杯法测定菌株拮抗能力，通过单因素试验对培养基成分和培养条件进行优化，利用Plackett-Burman试验筛选出3个显著影响因子，最后利用响应面法确定显著因子的最佳组合浓度。[结果]菌株JF48对细菌性条斑病菌的抑菌圈直径达（37±3） mm，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，其最佳产芽孢发酵条件为玉米粉14.69 g/L，豆粕粉 9.54 g/L，CaCl2 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，MgSO4 1.00 g/L，装液量50/250 mL，转速为 200 r/min，初始 pH 7.5，溫度 38 ℃，接种量1.0%，最高芽孢产量为3.6×109 cfu/mL，与优化前相比提高了105倍。[结论]菌株JF48对细菌性条斑病具有很强抗性，响应面法有效提高了其芽孢产量。

关键词解淀粉芽孢杆菌；细菌性条斑病；响应面法

中图分类号S435.111.4+9文献标识码A文章编号0517-6611（2017）16-0003-06

Study on Biocontrol of Bacterial Leaf Streak with Antagonistic Bacillus

WU Jianfei， ZHANG Jinlong， TIAN Di， BAI Xianfang* et al

（College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004）

Abstract[Objective] The aim was to screen a Bacillus strain with antagonistic ability to bacterial leaf streak and identify， and optimize the fermentation condition to enhance the spore production.[Method] We used Oxford cup method to determine the antagonistic ability； 16S rDNA sequence analysis was used to identify the strain； single factor and response surface tests to optimize sporulation conditions. [Result] The JF48 strain belonged to Bacillus amyloliquefaciens， and the diameter of the inhibition zone reached （37±3）mm； the optimal spore culture conditions of Bacillus amyloliquefaciens JF48 were as followsed： corn flour 14.69 g/L， soybean meal 9.54 g/L， CaCl2 2.00 g/L， NaCl 5.00 g/L， MgSO4 1.00 g/L， liquid volume 50 mL/250 mL， rotation 200 r/min， initial pH 7.5， temperature 38 ℃， inoculation 1.0%. Under this fermentation condition， the spore production of JF48 strain reached 3.6×109 cfu/mL， which was 105 times that of optimizing before.[Conclusion] The strain JF48 has a strong antagonistic ability to bacterial leaf streak and response surface method effectively improves its spore production.

Key wordsBacillus amyloliquefaciens；Bacterial leaf streak；Response surface methodology

基金项目2017年度广西高等教育创优计划教学相关项目——优势特色专业项目（优质本科专业）。

作者简介吴建飞（1990—），男，湖南株洲人，硕士，从事微生物学研究。*通讯作者，教授，硕士生导师，从事生物技术研究。

收稿日期2017-04-19

水稻细菌性条斑病（Bacterial Leaf Streak，BLS），简称细条病，是由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc）引起的一种水稻病害。细条病的发生具有流行性、暴发性和毁灭性等特点[1-2]，已经成为世界水稻种植区的主要病害之一，严重威胁到水稻的高产稳產[3]。目前，防治水稻细菌性条斑病的主要药物是噻唑类杀菌剂[4]。化学药剂在防治植物病虫害的同时也杀死了许多无害甚至有益的生物，同时也提高了植物病原菌的抗药性，对生态环境造成了严重的破坏。而以发展绿色农业为宗旨的生物防治，将会在农业生产中发挥越来越重要的作用，甚至可能替代化学药剂成为一个绿色安全的选择[5]。

解淀粉芽孢杆菌物种丰富，广泛分布在土壤和植物表面。近年随着解淀粉芽孢杆菌具有抑制多种植物病原菌能力的发现，成为了具有微生物农药发展潜力的微生物种类。笔者筛选分离得到的解淀粉芽孢杆菌JF48对水稻细菌性条斑病菌具有明显的抗性，提高了其芽孢产量，为解淀粉芽孢杆菌JF48应用于生物防治方面提供了参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。

拮抗菌株自土壤样品中分离纯化得到；水稻细菌性条斑病菌由广西大学生命科学与技术学院何勇强教授提供。

1.1.2培养基。

NA培养基：酵母膏5 g/L，牛肉膏1 g/L，细菌学蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，蔗糖10 g/L，pH 7.0。

种子培养基：细菌学蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0。

碳源基础培养基：酵母粉10 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0。

氮源基礎培养基：最适碳源5 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0。

无机盐基础培养基：氯化钠5 g/L，最适碳源5 g/L，最适氮源10 g/L，pH 7.0。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株的分离与纯化。

称取10 g样品土壤加入到装有少许玻璃珠和90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，在200 r/min、30 ℃条件下振荡摇匀30 min，制成1×10-1土壤悬浮液。吸取1 mL 1×10-1悬浮液至EP管中，80 ℃水浴15 min，按梯度依次稀释至1×10-7～1×10-2，吸取合适稀释梯度的稀释液1 mL于平板上均匀涂布，倒置于30 ℃培养箱中，24 h后进行观察，选取形态各异的单菌落。

1.2.2拮抗菌株的筛选和抑菌能力的测定。

初筛完成后，采用抑菌圈法对初筛得到菌株进行抑菌活性测定。测定时先在培养皿底部铺1层5 mL左右的水琼脂，以保证培养皿底部平整，冷却后在培养皿中间放置牛津杯，将完全融化的NA培养基冷却至50 ℃左右，每100 mL培养基中加入0.2 mL指示菌液（1×109 cfu/mL），摇匀，倒入平皿中，每皿15 mL左右，冷却后取出牛津杯，每孔加入0.1 mL待筛选菌液（1×109 cfu/mL），以加NA液体培养基为空白对照，每个处理3次重复，静置30 min，于30 ℃恒温培养箱中培养，48 h后观察抑菌效果，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.3拮抗菌株的鉴定。

提取拮抗菌株的基因组DNA，采用通用引物对16S rDNA进行扩增，纯化后送至华大基因科技有限公司进行测序。将测定的序列提交到 NCBI数据库，应用BLAST 程序与已有的基因序列进行同源性比对分析，下载同源性较高的序列，构建系统发育树。

1.2.4芽孢检测及芽孢转化率检测方法。

采用稀释涂布法对芽孢进行计数[6]，通过显微镜观察、计数，计算芽孢转化率。

1.2.5拮抗菌株产芽孢培养基成分及培养条件优化。

1.2.5.1单因素试验。试验内容包括碳源种类（葡萄糖、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉、麦芽糖、糊精）及其浓度（6.00、10.00、14.00、18.00、22.00 g/L）、氮源种类（胰蛋白胨、豆粕粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨）及其浓度（6.00、8.00、10.00、12.00、14.00 g/L）、无机盐（NaCl 5.00 g/L、 CaCl2 2.00 g/L、MgSO4 1.00 g/L、MnSO4 1.00 g/L、K2HPO4 0.10 g/L、 KH2PO4 0.10 g/L）、装液量[50/250（mL）、75/250（mL）、100/250（mL）、125/250（mL）、150/250（mL）]、转速（140、160、180、200、220 r/min）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、培养温度（29、31、33、35、37、39 ℃）、接种量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）。

1.2.5.2Plackett-Burman 试验。

根据单因素试验结果，以芽孢產量（cfu/mL）为响应值设计6个因子的Plackett-Burman（PB）试验筛选显著因子，每个因子取高（+1）、低（-1）2个水平，确定各个因子对芽孢产量影响的大小。试验因素与水平见表1。

1.2.5.3最陡爬坡试验。

根据 Plackett-Burman 试验结果筛选出3个显著影响因子及爬坡方向，以单因素试验结果为依据确定爬坡步长。其他因素取单因素最佳水平，通过最陡爬坡试验逼近芽孢产量最大值区域。试验设计见表2。

1.2.5.4Box-Behnken 试验。

以最陡爬坡试验中最优组合为中心点，使用Design-Expert 8.0.6设计3因素3水平Box-Behnken 试验，各因素水平设置见表3。

2结果与分析

2.1拮抗菌株的分离与筛选

从土壤中分离得到的菌株JF48对细菌性条斑病的抑制能力最强，其抑菌圈直径达（37±3）mm（图1）。测定JF48菌株最初在LB培养基中芽孢产量为3.4×107 cfu/mL。

2.2拮抗菌株的鉴定

拮抗菌株16S rDNA扩增片段检测结果如图2所示。测序结果进行BLAST分析，构建JF48菌株的系统发育树如图3所示。

测序所得序列进行同源性比较，结果表明，菌株JF48与解淀粉芽孢杆菌同源性高达99%，系统发育树中菌株JF48与解淀粉芽孢杆菌处于同一分支。因此，鉴定JF48菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

2.3单因素试验结果

2.3.1碳源种类及浓度的优化。

由图4可知，碳源种类对菌株JF48芽孢产量的影响非常显著，当以玉米粉为碳源时芽孢产量达0.95×108 cfu/mL，其芽孢转化率也最高。

由图5可知，玉米粉浓度为1.4%时芽孢数量和转化率达到最大，芽孢产量达1.88×108 cfu/mL。此后，随着玉米粉浓度的继续增加，营养物质过剩，不利于芽孢的形成，芽孢产量减少。

2.3.2氮源种类及浓度的优化。

由图6可知，不同氮源对菌体总量及芽孢转化率的影响有较大差异，以豆粕粉为氮源时芽孢量达5.87×108 cfu/mL，芽孢转化率达80%。

由图7可知，氮源浓度对菌体总量影响较大。在豆粕粉浓度为1.0%时芽孢产量达到最大值。

2.3.3无机盐种类的优化。

由图8可知，与对照组相比CaCl2、MgSO4能有效提高JF48菌株的芽孢产量和转化率。故选择向JF48培养基中加入CaCl2、MgSO4。

2.3.4装液量对芽孢产量和转化率的影响。

由图9可知，装液量对芽孢产量和芽孢转化率都有较大影响。装液量在50 mL时芽孢产量和芽孢转化率均最高，芽孢产量为1.46×109 cfu/mL。

2.3.5摇床转速对芽孢产量和转化率的影响。

由图10可知，随着转速的增加，芽孢转化率一直在提高，然而芽孢总数却先增后减，并在200 r/min时达到最大值。

2.3.6初始pH对芽孢产量和转化率的影响。

由图11可知，芽孢产量和转化率都在初始pH 7.5时达到最大值，芽孢量达1.48×109 cfu/mL。

2.3.7温度对芽孢产量和转化率的影响。

由图12可知，随着温度的升高，芽孢转化率变化不大，芽孢产量先增后减，并在37 ℃时达到最大值（3.03×109 cfu/mL）。

2.3.8接种量对芽孢产量和转化率的影响。

由图13可知，接种量在0.5%～2.0%时对芽孢产量影响很小，并在1.0%时达到最大值（3.06×109 cfu/mL）。

2.4Plackett-Burman 试验结果

试验设计及结果见表 4。方差分析表明，模型P=0.003 5，模型显著。A（玉米粉）、B（豆粕粉）、F（温度）3个因素影响显著。由P值可知，因素影响重要性大小为F（温度）>B（豆粕粉）>A（玉米粉），选取这3个显著影响因素进一步试验。

2.5最陡爬坡试验结果

根据 Plackett-Burman 试验结果可以得出，A（玉米粉）、B（豆粕粉）、F（温度）3个因素都为正效应，以芽孢产量的梯度方向作为爬坡方向，设计最陡爬坡试验，结果见表5。

2.6响应面试验结果由最陡爬坡试验可知，在第3组试验芽孢产量达到最大值，此时因素水平设置为A（玉米粉）15 g/L、B（豆粕粉）10 g/L、F（温度）38 ℃。以该试验组合为试验中心点进行响应面 Box-Benhnken 设计与分析（表6）。将试验结果输入设计表格，运行Design-Expert 8.0.6，对响应值进行多元回归拟合及方差分析。

试验所得模型回归拟合度P<0.000 1，说明该模型回归显著性好，芽孢产量与试验因素之间存在显著的回归关系。失拟值P（0.368）>0.05，模型的失拟项不显著，说明试验误差小。该模型的决定系数R2=0.991 9，校正决定系数R2=0.981 4，表明该回归方程求得的芽孢产量预测值的可信度为98.14%。

运用 Design-Expert 8.0.6得到3个显著影响因子两两相互作用的响应面三维图及等高线图。响应面曲线图凸起，则表明有与最大响應值相对应的最适变量组合。等高线的形状则可以形象地反映出因素间交互作用的强弱。如果等高線为椭圆形，表明2个因素的交互作用显著；若等高线近似圆形，则说明2个因素的交互作用不显著。

由图14可知，当温度一定时，随着玉米粉和豆粕粉浓度的增加，芽孢产量呈现明显先增加后减少的趋势，后期由于碳氮比例过高，碳源过剩反而不利于芽孢的形成；等高线图呈椭圆形，说明玉米粉和豆粕粉交互作用明显。

由图15可知，当豆粕粉浓度一定时，随着玉米粉、豆粕粉的增加，芽孢产量先增后减，后期碳源过剩会降低芽孢转

化率，温度过高会抑制菌体生长；等高线图呈圆形，说明玉米粉和温度交互作用不显著。

由图16可知，当玉米粉浓度一定时，芽孢产量受温度变化影响较大，受豆粕粉浓度影响较小；芽孢产量随着两者的增加呈现先增后减的趋势；等高线图呈椭圆形，说明豆粕粉和温度两者交互作用明显。

通过对响应面回归方程的求导，可以得出该模型的最大值。当A=14.69（g/L）、B=9.54（g/L）、C=38.26 ℃时，预测芽孢产量可达3.687 4×109 cfu/mL。

为了验证该模型的可行性，采用最佳培养条件进行验证。3次验证试验平均芽孢产量为3.6×109 cfu/mL，与模型预测值（3.687 4×109 cfu/mL）接近，说明该模型可以用来预测实际发酵情况。

3结论

从土壤中筛选得到的抗细菌性条斑病芽孢杆菌菌株JF48抑菌圈直径达（37±3）mm，表明其对细条病菌有很强的抗性，经16S rDNA鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；通过单因素和响应面试验得到其最佳产芽孢发酵条件：玉米粉14.69 g/L，豆粕粉 9.54 g/L，CaCl2 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，MgSO4 1.00 g/L，装液量50 mL/250 mL，转速为 200 r/min，初始 pH 7.5，温度 38 ℃，接种量1.0%。最终芽孢产量达3.6×109 cfu/mL，与优化前的3.4×107 cfu/mL相比提高了105倍，与预测值（3.687 4×109 cfu/mL）接近，说明该模型可以用来预测实际发酵情况。

参考文献

[1] 张荣胜，陈志谊，刘永锋.水稻细菌性条斑病研究进展[J].江苏农业学报，2014，30（4）：901-908.

[2] 戴新发，徐齐云，袁镜明.3%中生菌素可湿性粉剂防治水稻细菌性条斑病药效试验[J].广东农业科学，2009（12）：116.

[3] NIO LIU D O，RONALD P C，BOGDANOVE A J.Xanthomonas oryzae pathovars：Model pathogens of a model crop[J].Mol Plant Pathol，2006，7（5）：303-324.

[4] 邢家华，何荣林，张纯标，等.20%噻森铜悬浮剂对水稻白叶枯病和细菌性条斑病的田间防效[J].浙江农业科学，2007（5）：567-568.

[5] CALVO J，CALVENTE V，ORELLANO M E，et al.Biological control of postharvest spoilage caused by Penicillium expansum and Botrytis cinerea in apple by using the bacterium Rahnella aquatilis[J].International journal of food microbiology，2007，113（3）：251-257.

[6] 黄时海，盘慧群，黄广上，等.响应面法优化促植物生长枯草芽孢杆菌CK15产芽孢条件[J].安徽农业科学，2016，44（20）：25-29.