大肠杆菌Nissle 1917菌株荚膜多糖合成基因kfiA的功能研究

安翠英 周贤轩

摘要[目的]分析益生菌EcN的荚膜多糖合成基因簇，寻找致病性大肠杆菌K5菌株的肝素前体多糖替代来源。[方法]通过基因敲除、基因回补、1H核磁共振（NMR）检测等技术手段，研究了kfiA基因在EcN荚膜多糖合成过程中的功能。[结果]利用λ-red重组系统成功构建了kfiA突变株，利用NMR检测发现kfiA缺失突变株的荚膜多糖特征峰消失，又通过染色体重组技术，把kfiA基因插入了EcN突变株的基因组中，核磁共振检测重新发现了荚膜多糖特征峰。[结论]kfiA基因是EcN菌株荚膜多糖合成途径的一个关键基因，参与了荚膜多糖合成。λ-red重组系统与染色体重组技术同样适用于EcN菌株，可为后续的菌株改造提供参考。

关键词荚膜多糖；肝素前体；大肠杆菌Nissle 1917；核磁共振

中图分类号Q939.9 文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）23-0119-04

The Key Role of kfiA Gene in Synthesis of Capsular Polysaccharide of Escherichia coli Strain Nissle 1917

AN Cuiying，ZHOU Xianxuan*

（School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective] The aim was to analyze genes in heparosan synthesis of EcN heparosan， and find out alternative sources of heparin precursor polysaccharide for E. coli K5 strain. [Method] We studied the key role of kfiA gene in heparosan synthesis by using the techniques， such as gene knockout， gene knockin， NMR， and so on. [Result] The kfiA was knock out with the λred recombination system. The NMR analysis showed that disappeared the specific signal of heparosan from the kfiA mutant. Furthermore， the complementary strain with a kfiA gene inserted into the EcN chromosome was constructed with a phage helped recombination system. The insertion of kfiA restored the synthesis of heparosan and the specific signal of heparosan in the NMR spectrum. [Conclusion] The kfiA plays a critical role in the synthesis of EcN heparosan. Furthermore， both the λred recombination system and the phage helped recombination system are useful as a tool for strain engineering in EcN.

Key wordsCapsular polysaccharide；Heparosan；E. coli Nissle 1917；NMR

肝素是一種应用广泛的抗凝血药物。目前，药物类肝素主要从猪小肠黏膜等动物组织中提取纯化。动物源的肝素生产具有一些缺点，如病原污染[1]、货源不稳定、环境污染等。新的非动物源肝素是一个很有前景的替代品，如化学及酶法合成肝素[2]。受到成本和产量等因素的影响，很有必要对非动物源生物工程肝素及其衍生物的合成进行深入研究。

生物工程肝素的合成以肝素前体多糖为碳链骨架，需要对该糖链上的羟基进行磺基化修饰，使其具有抗凝血活性。肝素前体多糖主要提取自大肠杆菌K5菌株的荚膜，又可称为荚膜多糖。大肠杆菌K5菌株的肝素前体多糖的二糖骨架与肝素结构相似，但没有被硫酸化，其中的葡糖醛酸也没有被异构化为艾杜糖醛酸[3]。在E.coli K5基因组中，控制荚膜多糖合成的基因簇由3个不同的区域组成，即Region 1、Region 2和Region 3。其中，Region 1和Region 3的基因主要负责将多糖链从细胞内转运到细胞外；而Region 2 包括kfiA、kfiB、kfiC和kfiD基因，它们编码的蛋白质通常被认为参与了控制多糖链的合成。Region 1由6个基因（kpsFEDUCS）组成，是一个单独的转录单元。在kpsF上游处有一个δ70启动子（PR1）。Region 3的kpsM、KpsT基因负责转运多糖链跨过细胞膜。Region 3的启动子从kpsM基因上游741 bp处开始转录，控制Region 3及Region 2的基因表達。肝素前体多糖结构为[-GlcUA-β（1，4）-GlcNAc-ɑ（1，4）-]n，GlcUA表示葡萄糖醛酸，GlcNAc表示N-乙酰氨基葡萄糖，n的平均值约为70）[4]。

大肠杆菌K5菌株是一种病原菌，能够感染人的泌尿系统，形成生物被膜，难以治愈。因此，以大肠杆菌K5菌株的荚膜多糖作为肝素前体多糖的来源，存在安全风险。大肠杆菌Nissle 1917（EcN）菌株与大肠杆菌K5菌株的荚膜多糖合成基因簇具有相似性。EcN是肠道益生菌，有益生菌的诸多特性。它能够合成3种不同类型的菌毛粘附于肠上皮细胞，可有效地在肠道中定殖，形成较强的生物被膜以抵御病原菌的入侵。在肠道中，EcN形成生物被膜的能力要强于致病性大肠杆菌[5]。EcN分泌小菌素H47和小菌素M能够对其他病原菌产生拮抗作用[6]。EcN菌体表面的O6抗原具有特殊的脂多糖结构，EcN的这种特殊的多糖结构使其具有免疫调节作用，可以增强宿主体内的免疫调节能力[7]。EcN的H1型鞭毛使菌体具备较强的迁移能力，有利于菌体广泛分布。此外，这种益生菌还具有6种不同的摄铁系统，可通过竞争Fe3+来抑制鼠伤寒沙门氏菌等致病菌在肠道中的定殖[5]。为了找到致病性大肠杆菌K5菌株的肝素前体多糖替代来源，笔者分析了益生菌EcN的荚膜多糖合成基因簇，通过基因敲除、基因回补、NMR检测等技术手段，研究了kfiA基因在EcN荚膜多糖合成过程中的功能。

1材料与方法

1.1材料

克隆载体pKD4、pKD46、pCP20、pAH123、pAH162，大肠杆菌菌株EcN、BW25142，均由合肥工业大学生物与食品工程学院保存。高保真PrimeStar DNA聚合酶、限制性内切酶Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、DNA 连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver 2.1购于TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司；SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。引物（表1）设计采用Vector NTI 8.0软件，由通用生物系统（安徽）有限公司合成。大肠杆菌培养所用的抗生素为氨苄青霉素（Ap，100 μg/mL）、卡那霉素（Kan，50 μg/mL）、四环素（Tet，2 μg/mL）。

1.2方法

1.2.1EcN菌株中kfiA基因敲除。

EcN菌株中kfiA基因敲除采用已发表的大肠杆菌K12菌株基因敲除方法，并作少量修改[8]。根据EcN中kfiA基因编码区的序列（GenBank登陆号：AJ586888.1）上下游39 bp为同源臂设计扩增引物P0227/P0228。聚合物链式反应（PCR）以pDK4为模板扩增基因敲除片段FRT-Kan-FRT，反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后直接转化EcN/pKD46电击感受态细胞。卡那抗性平板用于kfiA突变株的筛选。

抗性平板上的單菌落重悬于超纯水中，作为PCR模板。PCR体系中加入4条引物，分别为抗性基因Kan上的通用检测引物P0019/P0020及EcN基因组kfiA基因上下游200 bp处的检测引物P0229/P0230。反应条件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃总延伸10 min。

1.2.2抗性基因的去除。

将温敏型质粒pCP20转化EcNΔkfiA：：Kan中，挑取单菌落于LB培养基（Ap 100 μg/mL），30 ℃过夜培养。取菌液划线于LB平板，42 ℃培养过夜（高温诱导质粒丢失）。将单菌落分别依次划线于Ap100板、Kan50板、LB板，37 ℃培养。选择只能在LB板上正常生长的菌落进行PCR检验。PCR检测得到的阳性菌送至通用生物系统（安徽）有限公司进行测序检验。利用Vector NTI 8.0软件将测序结果与预测序列进行比对。

1.2.3荚膜多糖的检测。将过夜菌液稀释至OD600=0.2，接至30 mL 新鲜培养基，37 ℃振荡培养过夜。以12 000 r/min离心5 min，收集上清液各10 mL，去离子水透析。冷冻离心干燥后的样品用500 μL D2O重悬，加入5 μL对苯二甲酸二钠作为内标，混匀后加入核磁管送样进行NMR分析[9]。

1.2.4pAH162-kfiA载体构建。

按照kfiA 基因序列设计引物：P0262/P0265，两端分别引入Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ，KpsMP扩增引物：P0011/P0012，两端分别引入Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ，两段DNA序列通过Pst Ⅰ 位点酶切连接成片段KpsMP-kfiA，连接体系通过胶回收得到目的条带。为了保证启动子KpsMP能够正常启动kfiA基因的转录，设计引物拼接P0291/P0292。将KpsMP-kfiA片段通过Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ 酶切连接构建到载体pAH162中，重组载体命名为pAH162-kfiA，重组载体通过测序鉴定。

1.2.5kfiA基因的回补。

将pAH162和重组载体pAH162-kfiA分别电击转化进电击感受态EcNΔkfiA/pAH123中，通过四环素抗性平板筛选得到的单克隆用PCR进行鉴定[10]。PCR体系中加入4条引物，分别为抗性基因上的通用检测引物P0028/P0029及EcN基因组IntΦ80位点的上下游检测引物P0078/P0079。反应条件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，46 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃总延伸10 min。获得的阳性克隆分别命名为EcNΔkfiA IntΦ80：： pAH162和EcNΔkfiA IntΦ80：： pAH162-kfiA。

2结果与分析

2.1EcN菌株中kfiA基因敲除高保真酶扩增质粒pKD4中的FRT-Kan-FRT片段，用于基因敲除。PCR产物片段长1 574 bp（图1a），電泳结果与目的片段大小一致。

利用λ-Red重组系统进行kfiA基因在EcN菌株中的敲除[8]。在EcN/pKD46菌株诱导表达的重组酶作用下，FRT-Kan-FRT片段中同源臂序列可以和基因组上的同源序列发生同源重组。利用PCR反应检测kfiA基因突变阳性克隆。菌落PCR体系中加入4条引物，条带大小分别为1 175、761 bp（图1b），电泳检测结果与预期相符，9个菌落全为阳性菌。

45卷23期安翠英等大肠杆菌Nissle 1917菌株荚膜多糖合成基因kfiA的功能研究

2.2kfiA突变株的荚膜多糖检测

利用1H核磁共振鉴定突变株是否能够合成荚膜多糖。首先提取EcN和EcNΔkfiA的荚膜多糖，将水溶性的稳定且不与样品反应的对苯二甲酸二钠添加到样品中作为内标，用1H核磁共振进行鉴定。得到谱图如图2a所示，可以看出在1H NMR谱约为2 ppm处存在特征峰，是荚膜多糖的N-乙酰基上的氢峰（GlcNAc，-CH3）。核磁波谱用MestReNova软件进行分析，利用峰面积对荚膜多糖的含量进行测定，如图2b所示，野生型能够正常合成荚膜多糖，而kfiA突变株完全不能合成荚膜多糖，说明EcN菌株的kfiA基因对该菌株荚膜多糖合成的重要性。

提取菌落PCR检测的阳性菌株的质粒，利用限制性酶切反应进行检验。电泳检测结果如图3b所示，质粒被限制酶切成2个片段，条带分别为2 883和1 776 kb，条带大小与预期相符。为了排除PCR扩增的DNA片段出现碱基突变和移码突变的可能性，试验中还对拼接的DNA片段进行了序列测定。测序结果与预期相符，没有碱基突变和移码突变。

2.4kfiA基因的回补

从菌落PCR检验、质粒酶切检验，以及测序检验都符合预期的菌株BW25142/pAH162-KpsMP-kfiA中提取质粒，并通过电击转化，将重组质粒转化进EcNΔkfiA/pAH123感受态中，菌落PCR检测结果如图4所示，泳道1和4以EcNΔkfiA为模板作为对照，泳道2和5、3和6分别是同一单克隆，在泳道1～3的PCR体系中加入4条引物：P0028、P0029、P0078、P0079，用来检测重组质粒是否插入IntΦ80位点，在泳道4～6的PCR体系中加入引物P0230/P0263用来检测原来的kfiA基因是否被敲除。

在泳道2、3中可以扩出2个DNA条带，且与预期大小相符，说明重组质粒已经成功插入到EcN基因组的IntΦ80位点。泳道5、6条带大小与泳道4（EcNΔkfiA）一致，说明所挑选的2个单克隆均为阳性克隆（EcN ΔkfiA IntΦ80：：pAH162-KpsMP-kfiA）。

2.5kfiA突变株及回补菌株的荚膜多糖检测

提取4株的荚膜多糖并通过1H核磁共振检测，核磁波谱用MestReNova软件进行分析。如图5a所示，EcN野生型和kfiA回补菌株能够正常合成荚膜多糖，而kfiA突变株和回补对照菌株不能合成莢膜多糖。将波谱中对二苯二甲酸二钠的峰面积（化学位移为7.9 ppm）作為标准，分别对4株菌的荚膜多糖的N-乙酰基的峰面积进行积分，结果如图5b所示，野生型和回补菌株能够正常合成荚膜多糖，而kfiA突变株和EcNΔkfiA IntΦ80：：pAH162完全不能合成荚膜多糖，说明kfiA基因是EcN荚膜多糖合成所必需的基因。

3结论与讨论

大肠杆菌可以表达超过80种荚膜多糖，这些荚膜多糖

被定义为K抗原。细菌的荚膜多糖通常对菌体的生长和繁殖有着重要影响，还对病毒的侵染具有较强的抵御作用[11]。大肠杆菌K5的荚膜多糖属于糖胺聚糖类多聚物。其中，K5荚膜多糖又被称为脱硫肝素，或N-乙酰肝素，由[（→4）β-D-GlcA（1→4）N-acetlyαDGlcNAc（1→）]n重复二糖单元组成。细菌的荚膜多糖未被硫酸化，也没有差向异构化形成艾杜糖醛酸，这与哺乳动物源的硫酸肝素在结构与活性上都有所差别。以K5荚膜多糖为起始碳链骨架，可通过酶法合成非动物源肝素，使其具有抗凝血活性。但是大肠杆菌K5菌株对人体具有致病性，可引起尿道感染。若从大肠杆菌K5的荚膜中提取肝素前体多糖用来合成肝素，必须非常小心，需要经过严格的多步纯化过程以排除致病因子污染。

据目前的报道，大肠杆菌EcN菌株是益生菌，还没有发现任何致病因子，被认为是一种安全菌株。在大肠杆菌EcN菌株中具有相似的荚膜多糖合成基因簇，但还缺乏相应的研究，证明这些基因的确切功能及相应的肝素前体多糖合成能力。该研究通过分子生物学技术，对kfiA基因的功能进行了研究，发现kfiA基因编码产物是该菌株的荚膜多糖合成所必需的蛋白质。kfiA基因的敲除使EcN失去了荚膜多糖合成能力；同时，

该基因的回复突变，又重新恢复了该菌的荚膜多糖合成能力。

目前，关于益生菌EcN肝素前体多糖合成的相应研究较少，该菌的肝素前体多糖合成机制还有更进一步的

研究价值。此外，对益生菌EcN肝素前体多糖生物合成的调控机制研究也将有助于研究宿主对病原菌的抵抗。该研究还表明了λ-red重组系统与染色体重组技术除了可应用于常见的无荚膜菌株之外，同样适用于具有荚膜覆盖的大肠杆菌EcN菌株，为后续的菌株改造奠定了技术基础。

参考文献

[1]

KISHIMOTO T K，VISWANATHAN K，GANGULY T，et al.Conta minated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system[J].The New England journal of medicine，2008，358（23）：2457-2467.

[2] TOSCHI V，LETTINO M.Fondaparinux：Pharmacology and clinical experience in cardiovascular medicine[J].Minreviews in medicinal chemistry，2007，7（4）：383-387.

[3] BENTOLILA A，VLODAVSKY I，HALOUN C，et al.Synthesis and heparinlike biological activity of a mino acidbased polymers[J].Polymers for advanced technologies，2000，11（8/9/10/11/12）：377-387.

[4] WANG Z Y，LY M，ZHANG F M，et al.E.coli K5 fermentation and the preparation of heparosan，a bioengineered heparin precursor[J].Biotechnology and bioengineering，2010，107（6）：964-973.

[5] HANCOCK V，DAHL M，KLEMM P.Probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 outcompetes intestinal pathogens during biofilm formation[J].Journal of medical microbiology，2010，59（Pt 4）：392-399.

[6] PATZER S I，BAQUERO M R，BRAVO D，et al.The colicin G，H and X deter minants encode microcins M and H47，which might utilize the catecholate siderophore receptors FepA，Cir，Fiu and IroN[J].Microbiology，2003，149（Pt 9）：2557-2570.

[7] SCHLEE M，WEHKAMP J，ALTENHOEFER A，et al.Induction of human βdefensin 2 by the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 is mediated through flagellin[J].Infection and immunity，2007，75（5）：2399-2407.

[8] DATSENKO K A，WANNER B L.Onestep inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（12）：6640-6645.

[9] YAN H H，BAO F F，ZHAO L P，et al.Cyclic AMP （cAMP） receptor proteincAMP complex regulates heparosan production in Escherichia coli strain Nissle 1917[J].Applied and environmental microbiology，2015，81（22）：7687-7696.

[10] HALDIMANN A，WANNER B L.Conditionalreplication，integration，excision，and retrieval plasmidhost systems for gene structurefunction studies of bacteria[J].Journal of bacteriology，2001，183（21）：6384-6393.

[11] ROBERTS I S.The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria[J].Annu Rev Microbiol 1996，50：285-315.