质子辐射诱变玉米M2代形态变异与RAPD分析

边晓萌　田安然　耿金鹏　丁兰　龚佳梦　胡金山　曹天光

摘要[目的]研究不同劑量质子辐射（PR）的白马牙玉米M2代的生长发育、形态和基因组DNA水平上的变异情况。[方法]对白马牙玉米干种子进行5种不同剂量的辐射处理，研究M2代玉米生长状况，采用RAPD分子标记技术研究M2代损伤和变异。[结果]发芽率随着剂量的增加先升高后降低，20、30 Gy处理的发芽率均高于对照，20 Gy处理最高；空秆率随着剂量的增加呈先升高后降低再升高再降低的马鞍型曲线，其中20 Gy和50 Gy处理最低，40 Gy处理空秆率最高，达29.4%；光合速率PR组显著低于对照，随着剂量的增加呈马鞍形曲线；籽粒千粒重随着剂量的增加呈马鞍形曲线，10、20和40 Gy处理显著高于对照，50 Gy处理低于对照。综合考虑发芽率、空秆率、千粒重，对白马牙玉米M2代产量的有益变异多的辐射剂量依次为20、10和30 Gy。RAPD试验分析中16条随机引物扩增出142条条带，其中多态性条带71条，多态性比例达57.3%，各PR组变异率为20.2%～32.3%；各组在遗传相似度0.73附近处聚为2类，10 Gy组与50 Gy组聚为1类，表明其变异程度较大，其他组与对照聚为1类。[结论]该研究可为今后辐射诱变玉米产生有益变异和培育新品种提供辐射剂量的指导和参考，也为拓展玉米种质奠定一定的基础。

关键词质子辐射诱变；玉米；马鞍形曲线；RAPD分析

中图分类号S513文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）33-0149-04

The M2 Morphological Variation and RAPD Analysis of Maize Irradiated by Proton

BIAN Xiaomeng，TIAN Anran，GENG Jinpeng，CAO Tianguang* et al

（Institution of Biophysics，School of Science，Hebei University of Technology，Tianjin 300401）

Abstract[Objective]The growth and development，morphology and variation of genomic DNA level in the M2 of maize were studied in different doses of proton radiation （PR）.[Method]Maize seeds were irradiated by different doses of proton（10、20、30、40、50 Gy）.We studied the growth status of M2 of maize，and studied the M2 damage and variation with RAPD molecular marker technology.[Result] The germination rate increased firstly and then decreased with the increase of the dose.The germination rate of 20 Gy and 30 Gy groups were higher than the control，and the 20 Gy groups was the highest.The empty bar rate was a saddle shaped curve，the minimum was at 20 Gy and 50 Gy，the highest was at 40 Gy and up to 29.4%.The photosynthetic rate of the maize of irradiation groups was significantly lower than the control，it showed saddle shaped curve with the dose increasing.The thousandgrain weight also showed saddle shaped curve with the dose increasing，its values of the groups of 10 Gy，20 Gy and 40 Gy were significantly higher than the control and the minimum was at 50 Gy.Comprehensive considering the germination rate，the empty bar rate and the thousandgrain weight，the radiation dose of producing useful variation of maize M2 generation was in the order 20 ，10 and 30 Gy.16 random primers were used on Random Amplified Polymorphic DNA，called RAPD experiment.All primers amplified 142 bands，71 polymorphism bands.The polymorphism bands ratio reached 57.3%，and the variation rate of irradiation group was between 20.2% and 32.3%.The result of genetic similarity clustering analysis showed that those groups were clustered into two categories.One included the 10 Gy group and the 50 Gy group，and the variation was high.The other included the 20，30 and 40 Gy groups and the control.[Conclusion]These works can provide a guidance and reference of radiation dose for the radiation induced maize to produce beneficial mutations and cultivate new varieties，and may lay a certain foundation for expanding the maize germplasm.

Key wordsProton radiation mutation； Maize； Saddle shaped curve；RAPD analysis

玉米为一年生禾本科草本植物，是目前全世界总产量最高的粮食作物，也是我国第一大农作物。除食用外，玉米深加工产业处于快速增长阶段，现阶段的玉米生产不能满足日益增长的需求，然而提高玉米种植面积已经非常困难，这就需要培育新的单产高的玉米品种。玉米种质资源是玉米育种的物质基础，而玉米种质资源的遗传脆弱性，已成为制约玉米育种发展的“瓶颈”因素。玉米种质扩增、改良和创新已成为其育种研究的重要发展方向[1]。近年来，随着辐射诱变技术迅速发展，越来越多的研究将这项技术应用到植物育种方面。对玉米的辐射诱变手段主要是采用重离子[2-3]、γ射线[4]以及航天搭载[5]等。质子辐射生物效应的研究一直以哺乳动物及其细胞材料为主，在医学领域应用较多[6]。20世纪90年代研究人员才开始用质子辐照植物种子，唐掌雄等[7]利用质子辐射麦类种子发现，M1代苗高和根长的变化与辐照剂量和射线能量有关；王彩莲等[8]用质子辐照水稻，获得了矮秆和千粒重增加等有益突变的新材料；孙逊等[9]利用质子束处理甜瓜种子发现，质子束处理对细胞染色体有一定的致畸效应，致畸类型以微核比例较高，并经6代选育获得了甜瓜早熟品种；施巾帼等[10]研究质子对小麦的诱变效应发现，不同能量的质子对小麦M1代生物损伤效果不同，能量越高损伤越严重，至6 MeV时损伤达到最大后随能量的提高又有所降低。目前质子辐射植物的生物效应主要集中在形态学、细胞学、生理损伤等方面，而采用随机引物扩增多态性DNA分子标记技术（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）对质子辐射诱变玉米的相关研究较少[11-12]。

该研究利用中国原子能科学研究院的串列加速器产生的质子对白马牙玉米干种子进行了5种不同剂量的辐射处理，研究了M2代玉米生长状况，采用RAPD分子标记技术研究了M2代损伤和变异，为进一步辐射诱变玉米产生有益变异提供辐射剂量的试验数据和参考，为拓展种质资源和培育玉米新品种提供参考，也为探索质子辐射诱变玉米的理论机制提供试验依据。

1材料与方法

1.1材料

供试材料是由河北省迁安市隆兴农业科技示范场提供的白马牙玉米干种子，经质子辐射（PR）后播种，采集二代（M2）的玉米叶片，以未经质子辐射（0 Gy）的玉米种子播种采集的二代叶片作为对照（CK）。

1.2诱变处理采用中国原子能科学研究院串列加速器国家实验室的串列加速器（HI-13）对玉米种子进行质子辐射，辐射剂量分别为10、20、30、40、50 Gy。

1.3光合速率测定

在37 ℃下于生长发育期选取生长一致、无病虫害的成熟叶片，测得净光合速率，在同一时间每个处理组测8株，取其平均值作为此处理组的光合速率。试验使用的是北京益康农科技有限公司的ECA-PB0402光合测定仪。

1.4RAPD分子标记

1.4.1DNA提取及有关检测。采用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒，提取玉米PR组及对照的DNA，经凝胶电泳成像系统（1%琼脂糖凝胶）检测，观察DNA的完整性。随后采用紫外分光光度计对所提取的样品逐一进行吸光度检测，DNA样品的OD260/OD280的值均为1.8～2.0，DNA纯度较好。

1.4.2体系优化及引物筛选。采用25 μL体系优化，优化结果：10.8 μL超纯水、2.5 μL Buffer、2.5 μL Dye、2 μL dNTP、4 μL引物、1.2 μLTaq酶、2 μLDNA模板。进一步以对照的DNA为模板，选用140种随机引物在一定条件下逐一扩增，后采用凝胶电泳成像系统（1.5%琼脂糖凝胶）检测，观察扩增结果，选出条带稳定性好、清晰度高、带型丰富的16条随机引物备用（表1）。

1.4.3PCR扩增。采用美国Bio公司的实时定量基因扩增仪进行DNA扩增。使用上一步骤中优化后的体系；扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；36 ℃ 1 min；72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存；扩增产物在含有EB的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE，最后用凝胶成像系统拍照记录结果。

1.5统计分析采用SPSS软件的单因素方差分析和LSD多重比较对光合速率测定结果进行数据分析。

根据RAPD随机引物扩增产物电泳图结果，扩增阳性记为1，扩增阴性记为0，建立数据库。采用NTsys软件对各处理组玉米进行聚类分析。各统计量定义如下：多态性条带比例=多态性条带数/对照扩增条带数×100%；种子发芽率=发芽种子粒数/供试种子粒数×100%；空秆率=空秆株数/成活总株数×100%。

2结果与分析

2.1玉米M2代种子发芽率和空秆率

发芽率能够更直观地显示种子的出苗状况，玉米的空秆率可直接影响其产量高低，这2项数据对准确估算玉米产量影响较大。PR组以及对照各播种20粒种子，统计其发芽率和空秆率，结果如图1所示。随剂量增加发芽率先增高后降低，PR 10 Gy处理与对照相同，为90%，20、30 Gy处理高于对照，20 Gy处理发芽率最高，40、50 Gy处理低于对照。随剂量增加空杆率呈现先升高（10 Gy）后降低（20 Gy）再增高（40 Gy）又降低（50 Gy）的馬鞍型曲线，其中40 Gy处理空秆率高达29.4%，20、50 Gy处理空秆率为0。

2.2玉米M2代主要性状及产量变异

穗高比（穗部高与株高之比）能在一定程度反映植株的抗倒伏能力，千粒重是体现种子大小与饱满程度的一项指标，也是田间预测产量时的重要依据。测量玉米的株高、穗位、千粒重，计算穗高比，并采用统计软件进行显著性分析，结果见表2。由表2可知，随剂量增加，株高先降低后增高，其中20 Gy处理株高显著降低；穗位无显著变化；穗高比先增高后降低再增高，20 Gy处理穗高比显著增加；千粒重先增高后降低再增高再降低，除50 Gy处理偏低外其他组都有所增加，其中10、20、40 Gy处理较其他处理显著增加。

2.3玉米光合速率情况

光合作用提供植物生长发育所需的物质和能量，是作物产量形成的基础。该试验白马牙玉米光合速率的测量结果如图2所示。结果表明，随剂量的增加，光合速率先降低后增加再降低又增加，PR组的光合速率均显著低于对照组。

2.4基因组DNA多态性

在该试验反应条件下，16条随机引物（表1）对PR不同剂量组和处理进行RAPD-PCR扩增，共扩增出142条条带，扩增产物为200～3 000 bp，其中多态性条带71条，多态性比例为57.3%。RAPD结果显示，16个引物扩增均出现不同程度多态性，主要表现为扩增条带的缺失、增加和深浅的变化。部分电泳结果见图3，其中箭头所指为条带的缺失或增加，引物A2在800～1 200 bp时，10、20 Gy处理各增加1条，50 Gy处理增加2条；引物A10在800～1 200 bp时，50 Gy处理缺失1条，500～800 bp时，10、50 Gy处理各增加1条，20、30、40 Gy处理各增加1条。

为研究不同处理组对玉米遗传物质的影响，统计了各处理组的多态性比例。由表3可知，PR组的多态性比例为20.2%～32.3%，呈现出随剂量的增加先增高后降低再增高的趋势。10、50 Gy处理明显高于其他剂量组，表明其变异程度较大。20 Gy处理多态性最低。结果表明，质子辐射的二代白马牙玉米在基因水平上变异明显，在基因多态性上表现出马鞍型曲线关系。

基于遗传相似度，利用NTsys软件做聚类分析，结果见图4。由图4可知，遗传相似度0.73附近处聚为2类，其中质子20、30、40 Gy处理组与对照聚为1类，质子10 Gy与质子50 Gy处理聚为1类。

3结论与讨论

该研究对白马牙玉米种子经质子辐射后的M2代种子萌发情况和植株生长中出现空秆情况做了统计，发芽率在0～

50 Gy剂量时随着剂量的增加先升高后降低，10 Gy处理与对照相同，为90%，20、30 Gy处理均高于对照，20 Gy处理发芽率最高为100%，40、50 Gy处理低于对照。空秆率随着剂量增加，在0～50 Gy时呈现先升高（10 Gy）后降低（20 Gy）再增高（30、40 Gy）又降低（50 Gy）的马鞍型曲线，其中40 Gy处理空秆率显著增加，达29.4%，20、50 Gy处理无空秆出现。籽粒千粒重随着剂量的增加，在0～50 Gy时呈马鞍形曲线，10、20和40 Gy处理显著高于对照（分别较对照增高15.3%、134%和9.2%），50 Gy处理低于对照。综合考虑发芽率、空秆率、千粒重，白马牙玉米M2代的产量由高到低依次为处理20、10、30、0（CK）、50和40 Gy。对白马牙玉米产量提高的有益变异多的辐射剂量可能为20、10、30 Gy，这可以作为质子辐射诱变玉米和下一步研究的参考剂量。

对质子辐射后玉米光合速率测定的结果显示，辐射组的光合速率在0～50 Gy时随剂量的增加先降低后增加再降低又增加，且辐射组显著低于对照组。唐掌雄等[7]利用质子辐射麦类种子发现M1幼苗出现条状叶绿素缺失的现象。赵洪兵等[13]研究空间环境诱变小麦叶绿素缺失突变体的光合特性，发现小麦叶绿素缺失突变体的光合作用受到显著影响。是否为质子辐射白马牙玉米产生叶绿素缺失进而影响光合速率，需要进一步试验研究。

辐射处理植物干种子可对其产生非遗传生理损伤和基因突变。该研究RAPD试验结果中质子辐射10 Gy的多态性条带比例最高，为32.3%，其次是质子50 Gy，为31.5%，其他组比例均在20%以上，可见质子辐射在白马牙玉米二代植株分子水平上发生明显变异。根据遗传相似性聚类分析结果显示，各组在遗传相似度0.73附近处聚为2类，质子10 Gy与50 Gy聚为1类，其他组为1类。该试验中质子10、50 Gy与对照的遗传距离较远，变异程度较大，结合聚类分析及多态性条带比例考虑，质子10 Gy与50 Gy影响变异效果相近，且变异率较高。

综上所述，质子辐射白马牙玉米的M2代，空秆率、籽粒千粒重和光合速率随剂量增加在0～50 Gy时呈现马鞍型曲线。对白马牙玉米产量提高的有益变异多的质子辐射剂量依次为20、10、30 Gy。RAPD及聚类分析结果显示质子10 Gy与50 Gy聚为1类，变异率较高。这可以为质子辐射诱变玉米提高产量、最优剂量培育玉米新品种、拓展玉米种质提供参考，为进一步研究辐射引起植物变异的机理和马鞍型曲线产生的机理提供一定的基础试验数据。

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