叠氮化钠（NaN3）诱变在作物性状改良中的应用

钱玉源 韩轩 刘祎 崔淑芳 张海娜 王广恩 金卫平 李俊兰

摘要化学诱变是作物改良中变异性状的重要来源之一，是目前应用较为广泛的诱变育种技术。综述了以叠氮化钠（NaN3）为诱变剂的化学诱变技术在作物性状改良方面的研究进展，并展望了NaN3诱变的应用前景，以期为相关研究者提供参考。

关键词叠氮化钠（NaN3）；化学诱变；性状改良

中图分类号S503.52文献标识码A文章编号0517-6611（2017）35-0136-03

AbstractChemical mutagenesis is one of the most important sources of variation traits in crop improvement. It is the most widely used mutagenic breeding technology. In this paper， the chemical mutagenesis technology with sodium azide （NaN3） as a mutagen was reviewed， and the research progress on the improvement of crop characters was reviewed， the application of sodium azide was prospected，in order to provide reference for the relevant researchers.

Key wordsSodium azide（NaN3）；Chemical mutagenesis；Character improvement

变异是生物进化的基础动力，也是保证物种多样性的前提[1]。然而自然变异的频率极低，很难满足作物改良对变异的需求。自20世纪初开始，科学家们尝试利用化学药剂诱发基因突变，结果证明化学试剂可以显著提高生物突变率。1941年，Auerbach和Robson第一次发现芥子气可以诱发基因突变从而揭开了化学诱变育种的序幕[2]。

化学诱变技术具有使用方便，特异性较强和诱变后代较易稳定遗传等特点，已成为利用较为广泛的诱变育种技术[3]。

叠氮化钠（NaN3）是作物育种中最常用的化学诱变剂之一，其以碱基替换的方式，影响DNA的正常合成，使DNA单链断裂，是一种有效点突变剂。NaN3对农作物诱变效率高，M1代生理损伤小，使用方便和费用低廉，是一种安全、高效的化学诱变剂[3]。

1NaN3诱变的机理

NaN3为前诱变剂，本身不具有诱变效应，需要通过植物代谢活动转变成诱变剂。NaN3被植物吸收后，经植物代谢，转化成L-叠氮丙氨酸（一种氨基酸类似物）。叠氮丙氨酸进入细胞核后，在DNA复制时与DNA发生作用，诱导基因组产生点突变[4]。

NaN3在pH=3的酸性介质中诱变效果更好。在pH=3的酸性介质中，N3-结合H+生成HN3，不带电荷的HN3更容易穿过细胞膜进入到细胞中，经L-叠氮丙氨酸酶催化产生具有诱变活性的L-叠氮丙氨酸[5]。

NaN3处理的材料需处在DNA复制活跃状态，以种子为处理材料时需要提前浸种处理，使种子处于萌动状态[6]。

2 NaN3在作物改良中的应用

种质资源是作物改良的遗传基础，然而目前亲本材料遺传多样性的狭窄限制了作物改良的进程。化学诱变方法是应用比较成熟的创制种质材料的方法之一，加之其操作简单和费用低廉深受育种者的青睐。NaN3作为最常用的化学诱变剂之一，已成功应用于多种作物农艺性状改良和基因功能验证。

2.1处理方式

NaN3诱变处理方式可以分成两大类：NaN3单一处理和NaN3与其他诱变剂（方法）复合处理。复合处理与单一处理相比，对于不同的作物或不同的性状有着不同的诱变效率。所以在选择处理方式时，需要根据作物自身和待改良的性状，参考已有的研究结果，选择适合的处理方式。

2.1.1单一处理诱变效率高于复合处理。

在CO2激光与NaN3、γ射线复合处理水稻的诱变效应研究中发现，NaN3和γ射线单一处理较激光与NaN3或γ射线复合处理，叶绿素和高秆突变频率有所提高。而早熟突变和矮秆突变频率显著提高，表现出明显的累加效应。尤其是γ射线加激光处理的早熟突变频率达1.35%，NaN3加激光处理的矮秆突变频率达3.11%，是较为理想的诱变方法[7]。

2.1.2复合处理诱变效率高于单一处理。

利用γ射线与NaN3复合处理烟草，研究其对于烟草农艺性状的诱变效应，发现复合处理较单一处理可以提高M2代的突变频率[8]。

复合处理在苗高、根长、苗高活力指数和根长活力指数方面表现累加效应，在染色体畸变方面存在协同作用[9]。用4个粳型水稻品种为材料，研究了30 keV下4种剂量N+离子注入和2种浓度NaN3单独和复合处理的生理效应和诱变效应。结果表明，与单独处理相比，复合处理的生理损伤加剧，M2代叶绿素突变频率增高，提高了诱变效率。4.0×1016 N+/cm2和6.0×1016 N+/cm2离子注入复以2.0 mmol/L NaN3处理，以及4.0×1016 N+/cm2和8.0×1016 N+/cm2离子注入复以1.0 mmol/L NaN3处理的叶绿素突变频率依次为2.96%、316%、1.24%和1.87%（M2代苗计），比对应剂量下2种诱变剂单独处理的叶绿素突变频率之和1.89%、2.22%、123%和1.39%要高[10]。

航天搭载促进有丝分裂，复合处理同航天搭载相比，甘蓝型油菜种子的根尖细胞对有丝分裂有抑制效应。同时，复合处理与2个单处理相比，可使多数甘蓝型油菜产生较高频率的染色体畸变[11]。

2.1.3复合处理和单一处理诱变效应相当。

为筛选抗咪唑乙烟酸水稻，进行了水稻种子敏感性检测以确定筛选浓度。应用紫外线、NaN3及复合诱变对种子进行诱变筛选。结果表明，抗性筛选的适宜药剂浓度为0.3 mL/L；在此浓度下，经75 W紫外灯照射1、2、3 h的种子未筛选出抗性植株；种子经不同浓度、时间NaN3处理后筛选出抗性植株，以NaN3诱变剂量为4 mmol/L×2 h时抗性比率最高，出苗率为7.14%；相比NaN3诱变，复合诱变的种子并没有显著不同。将筛选出的植株苗期喷5 mL/L咪唑乙烟酸，筛选出4株对咪唑乙烟酸有抗性的水稻植株[12]。

2.2诱变效应

2.2.1诱变品种。

作物诱变的最终目标是培育出性状优良的作物新品种。利用NaN3诱变，提高作物的突变频率，已培育出一些新类型、新性状的作物品种。

以NaN3为诱变剂，诱变处理澳大利亚Au1990sp紫甘薯胚性细胞团，获得99个变异株系，从中筛选出3个高产株系，编号为CA06、CA11和CA17。3个高产株系产量分别达43.98、40.03和43.84 t/hm2，而对照组Au1990sp产量仅为4.95 t/hm2。对高产株系进行12年的连续筛选，选育出紫薯新品种甬紫薯1号，2012年12月通过浙江省審定[13]。

采用NaN3与甲基磺酸乙酯（EMS）复合诱变中翼1号种子，经过6代连续选育，育成了四棱豆新品种湘棱豆3号，2010年10月通过湖南省审定。湘棱豆3号中早熟，不易纤维化并且耐热，抗根腐病、果腐病等病害，一般嫩荚产量为14.8 t/hm2[14]。

2.2.2抗逆性状。

NaN3诱变是作物提高抗逆性的有效途径。NaN3诱变处理，可以有效改良作物的抗盐、抗旱、抗寒和抗病虫害等性状。

2.2.2.1抗旱性。

干旱缺水是世界农业生产面临的严重问题，也是制约我国农业和经济发展的重要因素。由于降水量不足或降水模式改变而造成的干旱在众多非生物胁迫中是最具有破坏性的，同时也是限制作物产量的一个重要影响因素。选育抗旱性强、具有优良农艺性状的品种（ 系）使之适应干旱环境条件，是解决作物抗旱性的重要途径。抗旱育种的关键是抗旱种质材料的创制，化学诱变是创制抗旱种质的有效途径。

NaN3诱变玉米愈伤组织，获得22个再生植株株系，对再生植株株系进行耐旱性鉴定，筛选出5个耐旱性高于未诱变对照的诱变株系，其中1个株系的耐旱性接近于耐旱自交系81565[15]。

利用NaN3和γ射线复合诱变玉米自交系18-599，获得了一个抗旱性明显提高的变异株系18-599M。在人工和自然干旱胁迫条件下，对18-599M的M2～M4代材料进行抗旱性评估，发现18-599M的抗旱性均显著高于18-599[16]。

2.2.2.2抗盐性。

土壤盐渍化对农业的影响是一个全球性的问题，全球20%的耕地和近50%的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁，所以植物抗盐育种一直是研究热点。虽然采用传统的方法选育耐盐碱的植物品种简便可行，但抗盐种质缺乏限制了传统育种方法的利用。利用NaN3诱变谷子、小麦和凤尾鸡冠花已获得了抗盐性显著提高的种质。

谷子幼穗和小冠花子叶的愈伤组织经NaN3诱变后，分别以NaC1和脯氨酸类似物L-羟基脯氨酸（Hyp）为筛选剂，获得了耐盐性较对照相比明显增强的细胞系。对后代分析后发现，与对照系相比，生理生化特性方面耐盐系抗氧化系统SOD和POD酶活性显著提高，SDS-PAGE凝胶电泳分析，耐盐系可溶性蛋白的质和量都发生了显著的变化；分子水平上，RAPD多态分析发现耐盐变异体较对照存在分子标记多态性，表明了抗性系基因组DNA分子水平发生了变化[17-18]。

从NaN3诱变小麦M3代中，筛选获得了耐高渗能力提高的突变材料422。研究发现，该突变材料叶片中钾积累量远远高于野生型材料，并且耐盐能力也显著高于野生型材料。从而证实了钾对植物耐受力起积极影响的假设[19]。

利用RAPD技术对凤尾鸡冠花耐盐突变体进行遗传特性分析，发现耐盐突变体与对照相比，9个引物出现差异条带，变异率为31.73%，说明NaN3能有效诱导凤尾鸡冠花的基因变异[20]。

2.2.2.3抗寒性。

低温是限制作物生长和分布的一种非生物胁迫因子。低温寒害是农业生产中一种严重的自然灾害，受害面积广，损失大。虽然作物本身具有一定的抗寒性，但是不同作物种类和品种有不同的抗寒性，不同器官的抗寒性也不一样。诱变是提高植物抗寒性的有效途径，这对于避免和减少寒害损失有重要意义。

将草原2号、准格尔、龙牧801这3个苜蓿品种的幼茎愈伤组织经NaN3诱变处理后经-7 ℃低温筛选，3个品种均获得了抗寒性显著高于对照的愈伤组织。通过测定变异愈伤组织的可溶性糖含量、过氧化物酶活性以及脯氨酸含量等生理生化指标，验证了3个苜蓿品种诱变处理后愈伤组织的抗寒性明显高于对照[21-22]。

2.2.2.4抗病虫害。

在肯尼亚，寄生杂草独脚金严重威胁主要作物玉米和高粱的生产。埃格顿大学研究者利用NaN3诱变处理玉米，获得了能够抑制独脚金种子萌发和寄生现象发生的玉米株系。诱变获得的这些株系材料可以用于选育抗独脚金的玉米品种，另外在这些株系中K9908、K9910和K9911有较高的抗性，这些材料可以用于研究玉米抗独脚金的机理，挖掘控制抗独脚金的相关基因[23]。

3个北美啤酒大麦品种，经NaN3诱变处理后获得了不同抗性的抗霉病植株。在抗病植株中，URS1和PRU1这2个突变株，表现出了对霉病的完全抗性，并且该性状由mlo位点的2个新等位基因mlo31和mlo32控制。突变株URS2，是一个不完全抗性株，是由一个显性基因控制的，但该基因不是Mla位点的等位基因[24]。

2.2.3矮化变异。

矮秆高产杂交小麦带来了第一次绿色革命，矮秆性状是很多作物高产的保障，诱变可以诱导作物产生矮化突变。矮秆材料具有抗倒伏和可实现密植的优点，可以成为作物育种改良方向和研究高产作物的重要参考依据。

全妙华等[25]采用0.3%甲基磺酸乙酯（EMS）和0.325% NaN3复合诱变剂处理四棱豆种子，筛选获得了矮化突变性状。田间调查表明，矮化突变体的主蔓长、一级分枝数、百粒重等主要农艺性状与对照存在明显差异。

NaN3处理大豆品种黑农37、抗线2号、东农42号、东农92-07，后代株系中出现了矮化表型[26]。

用NaN3处理大豆种子，在M1植株群体中筛选出许多突变体，其中1株突变体为矮秆HK808，株高为原品种东农42的50%，HK808已经稳定遗传。该突变体的培育将为大豆基因结构和功能调节以及“窄行矮秆密植”模式的研究奠定基础[27]。

2.2.4雄性不育突变体。

雄性不育系是实现杂交种规模化制种和商业化利用的必要条件，然而自然界中可用雄性不育系资源较少，从已有的育种材料中筛选获得的难度较大。利用NaN3可以有效诱导不同作物产生雄性不育突变体，供育种所用。

NaN3诱变处理大豆品种南农86-4，獲得了雄性不育突变体NJS-1H。该突变体从减数分裂到花粉粒发育成熟都有败育发生，但大量败育主要发生在减数分裂阶段。对突变体后代育性分离株系及株系群的遗传分析，发现雄性不育性状受1对隐性核基因控制[28]。

四棱豆种子经0.3%甲基磺酸乙酯（EMS）和0.325%NaN3复合诱变处理后，获得了雄性不育突变体。突变体与野生型可由9条ISSR引物明显区分，表明该突变性状是由基因突变引起的。通过与野生型进行表型比较发现，该突变体在株高、叶色、茎秆形状、茎秆颜色等方面与野生型无明显差异[29]。

60Coγ射线和NaN3复合处理玉米愈伤组织，从M1代株系中筛选出了1个细胞核隐性单基因控制的孢子体雄性不育株[30]。

2.2.5抗草甘膦。

抗除草剂作物，可以减少作物生产中的劳动力投入，降低生产成本，提高农民收入。但自然界中能够抗除草剂的作物类型很少，能同时抗多种除草剂的作物就更少见，对某种高效除草剂的抗性也往往仅限于少数几种作物。诱变能够诱导作物产生抗除草剂突变性状，是创制抗除草剂作物的有效途径。

5 mmol/L NaN3诱变处理绥农10和黑农446的大豆种子，利用3叶期喷洒1.31 kg/hm2草甘膦的方法进行抗草甘膦突变株筛选，筛选获得40株抗草甘膦突变株，对突变株M4代进行鉴定，抗草甘膦特性可以稳定遗传[31]。

应用紫外线和NaN3分别对水稻种子和小麦进行诱变，在含有不同浓度草甘膦的溶液中进行种子筛选。分别筛选出4株抗草甘膦的水稻植株和4株抗草甘膦的小麦植株[32-33]。

2.2.6早熟性状。

早熟性状是作物丰产稳产和品质的保障。NaN3诱变处理不同作物，可以有效改良作物的早熟性状。

应用CO2激光与NaN3、γ射线复合处理迟熟晚糯浙糯2号水稻种子，早熟突变和矮秆突变频率显著提高，表现出明显的累加效应，γ射线加激光处理的早熟突变频率达135%，NaN3加激光处理的矮秆突变频率达3.11%，是较为理想的诱变方法[7]。

沈法富等[34]将0.5 mmol/L的NaN3经花粉管注入到完成受精的冀棉6号的胚囊中，从变异后代中筛选获得了一个较冀棉6号熟期早25 d的早熟品系，且该性状可以稳定遗传。

3展望

诱变技术和基因工程技术是人工创造变异的主要技术手段。但相较基因工程技术，诱变技术不易受作物种类、基因型等影响，几乎可以应用于所有的作物突变的创制；而且诱变技术易掌握，周期短，可以高效诱发突变。其中化学诱变比物理诱变更安全、更经济，对实验室条件要求更低，应用更广泛。

虽然化学诱变技术已经被广泛地应用于作物的性状改良，但突变的无方向性增加了后代筛选的难度，限制了化学诱变育种效率。随着分子水平检测技术的发展，化学诱变技术和分子辅助选择技术相结合，在分子水平上检测突变的发生，有效提高了突变选择的准确性和效率，加速了作物性状改良的进程。今后随着测序技术和分子标记的进一步发展，突变的检测方法将会越来越简便有效，从而推动诱变技术的进步，拓宽诱变技术在作物性状改良方面的应用。

安徽农业科学2017年

参考文献

[1] 董颖苹，连勇，何庆才，等.植物化学诱变技术在育种中的运用及其进展Ⅰ.化学诱变技术及诱变效率[J].种子，2005，24（7）：54-58.

[2] AUERBACH C，ROBSON J M.Chemical production of mutations[J].Nature，1946，157：302.

[3] 钮力亚，于亮，付晶，等.叠氮化钠在农作物育种中的应用[J].河北农业科学，2010，14（12）：52-53.

[4] ALQURAINY F，KHAN S.Mutagenic effects of sodium azide and its application in crop improvement[J].World applied sciences journal，2009，6：1589-1601.

[5] 李清国，付晶，钮力亚，等.化学诱变及其突变体筛选在育种中的应用[J].河北农业科学，2010，14（5）：68-72.

[6] 韩微波，刘录祥，郭会君，等.小麦诱变育种新技术研究进展[J].麦类作物学报，2005，25（6）：125-129.

[7] 骆荣挺，张铭铣，沈守江.CO2激光与叠氮化钠、γ射线复合处理水稻的诱变效应[J].核农学通报，1996，17（5）：217-220.

[8] 任学良，王轶，杨春元，等.γ射线与NaN3复合处理对烟草几种主要农艺性状的诱变效应[J].中国烟草学报，2008，14（1）：23-26.

[9] 王彩莲，慎玫，徐刚，等.137Csγ射线与叠氮化钠复合处理水稻的诱变效应[J].核农学报，1993，7（1）：21-28.

[10] 谢嘉华，夏英武，舒庆尧.水稻离子注入和叠氮化钠复合处理生物学效应研究[J].核农学通报，1993（2）：84-87.

[11] 谢琳，牛应泽，郭世星.航天搭载与NaN3处理对甘蓝型油菜根尖细胞的诱变效应[J].中国农业科学，2008，41（12）：4250-4256.

[12] 宋鹏，魏松红，王艳辉，等.不同诱变方法对抗咪唑乙烟酸水稻筛选的影响[J].沈阳农业大学学报，2009，40（5）：541-545.

[13] 王芳，魏章焕，陆兴苗，等.化学诱变甘薯新品种甬紫薯1号的选育[J].浙江农业学报，2015，27（12）：2061-2064.

[14] 全妙华，陈东明，蒋向辉，等.四棱豆新品种‘湘棱豆3号[J].园艺学报，2011，38（9）：1827-1828.

[15] 付凤玲，李晚忱，荣廷昭，等.用γ射线和叠氮化钠诱变的玉米愈伤组织筛选耐旱和雄性不育材料[J].核农学报，2005，19（5）：356-359.

[16] HE J，HU Y，LI W C，et al.Drought tolerant mutant induced by gammaray and sodium azide from maize calli[J].Maize genetics cooperation newsletter，2009，83：53-55.

[17] 韩晓玲.小冠花抗L-羟基脯氨酸（Hyp）变异系离体筛选及其耐盐性研究[D].西安：西北大学，2006.

[18] 景建洲.谷子耐盐变异体和草木樨状黄芪抗乙硫氨酸变异体的筛选[D].西安：西北大學，2000.

[19] RASCIO A，RUSSO M，MAZZUCCO L，et al.Enhanced osmotolerance of a wheat mutant selected for potassium accumulation[J].Plant science，2001，160（3）：441-448.

[20] 王霞，刘晓丹，于晓明.凤尾鸡冠花耐盐突变体的RAPD鉴定[J].吉林农业，2016（23）：80-81.

[21] 李波，贾秀峰，高美玲，等.诱变苜蓿愈伤组织抗寒性研究[J].草地学报，2004，12（2）：95-97.

[22] 李波，白庆武，马兰，等.苜蓿抗性变异细胞系的筛选[J].草业科学，2003，20（4）：5-9.

[23] KIRUKI S，ONEK L A，LIMO M.Azidebased mutagenesis suppresses Striga hermonthica seed germination and parasitism on maize varieties[J].African journal of biotechnology，1993，5（10）：866-870.

[24] MOLINACANO J L，SIMIAND J P，SOPENA A，et al.Mildewresistant mutants induced in North American twoand sixrowed malting barley cultivars[J].Theoretical and applied genetics，2003，107（7）：1278-1287.

[25] 全妙华，陈东明，蒋向辉，等.四棱豆的化学诱变及矮化突变性状初步分析[J].江苏农业科学，2010（6）：219-221.

[26] 姜振峰，刘志华，李文滨，等.叠氮化钠对大豆M1的生物学诱变效应[J].核农学报，2006，20（3）：208-210.

[27] 苍晶，李茫雪，张达，等.矮秆大豆突变体叶片和豆荚生理特性的初步分析[J].核农学报，2007，21（6）：562-566.

[28] 李曙光，赵团结，盖钧镒.大豆突变体NJS-1H核雄性不育性的细胞学与遗传学分析[J].大豆科学，2010，29（2）：181-185.

[29] 全妙华，蒋向辉，阳小凤，等.四棱豆雄性不育突变体鉴定与ISSR初步分析[J].江苏农业科学，2009（4）：161-163.

[30] 付凤玲，李晚忱，荣廷昭，等.用γ射线和叠氮化钠诱变的玉米愈伤组织筛选耐旱和雄性不育材料[J].核农学报，2005，19（5）：356-359.

[31] 张俐俐，谷维，雷勃钧，等.应用化学诱变法筛选抗草甘膦大豆突变株系[J].大豆科学，2009，28（5）：938-940.

[32] 魏松红，纪明山，张希科，等.应用诱变法筛选抗草甘膦水稻植株[J].农药，2006，45（11）：735-736.

[33] 魏松红，纪明山，王英姿，等.应用诱变法筛选抗草甘膦小麦植株初步研究[J].现代农药，2006，5（3）：42-43.

[34] 沈法富，于元杰，尹承俏.棉花合子期化学诱变获得的早熟品系及其RAPD分析[J].遗传学报，1999，26（2）：174-178.