富硒酵母菌的筛选及其富硒条件的优化

朱威　高兆建　李勇　焦魏　曹泽虹　孙会刚

摘要[目的]选育高富硒酵母菌株，优化发酵培养条件，以提高酵母生物富集、转化有机硒的能力。[方法]以耐受亚硒酸钠强的菌株为出发菌株，研究该菌株在培养过程中的亚硒酸钠添加量、添加时间、酵母菌接种龄、培养温度等参数，从而达到最优的酵母生物量及富硒量。[结果]研究表明，酵母菌FX5菌株具有较高的耐受性和富硒能力。发酵条件优化表明，FX5菌株在亚硒酸钠添加量为20 g/L、添加硒的时间为6 h，富硒效果最好。在最佳的摇瓶培养条件下（初始硒浓度20 μg/mL，接种量10%，装液量50/250 mL，温度28 ℃，初始pH 6.0，摇床转速160 r/min，接种龄84 h，培养60 h后），该酿酒酵母的生物量及富硒量分别达到40.1 g/L、1 120 mg/L。[结论]该研究可为富硒农牧业生产提供一种安全的有机硒源。

关键词生物富硒；酵母；有机硒

中图分类号TS201.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0087-03

Screening and Optimized Culture of Seleniumenriched Saccharomyces cerevisiae

ZHU Wei1，GAO Zhaojian2*， LI Yong2 et al

（1. Jiangsu Zhi Hui Biotechnology Co. Ltd.， Xuzhou ，Jiangsu 221008；2.College of Food （Biological） Engineering， Xuzhou Institute of Technology， Xuzhou，Jiangsu 221008）

Abstract[Objective]To select high selenium enriched yeast strains and optimize fermentation conditions to improve yeast bioaccumulation and transformation ability of organic selenium. [Method]With sodium selenite tolerance strong strain as the starting strain， the strain in the training process of sodium selenite adding amount and adding time， yeast inoculation age， culture temperature and other parameters， so as to achieve the optimal amount of biomass and selenium enriched yeast. [Result]The results showed that yeast FX5 strain had high tolerance and selenium accumulation ability. The optimization of fermentation conditions showed that the addition of sodium selenite was 20 g/L and the time of adding selenium was 6 h， and the effect of selenium enrichment was best for FX5 strain. In the best shake flask culture conditions （initial selenium concentration 20 g/mL， inoculum size 10%， medium volume 50/250 mL， temperature 28 ℃， initial pH 6， rotation speed of 160 r/min， 84 h age of inoculation， after cultured for 60 h）， biomass and Se content of the yeast were respectively 40.1 g/L， 1 120 mg/ L. [Conclusion]The study can provide a safe organic selenium source for the production of selenium enriched agriculture and animal husbandry.

Key wordsBioconcentration of selenium；Yeast；Organic selenium

硒是人和动物所必需的微量元素，在生物体内是谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心元素，该酶能够清除人体中的自由基并防止细胞膜氧化受损[1]。缺硒可能引起人体重要器官功能失调并导致癌症、心脑血管疾病、糖尿病、肝病、甲状腺激素失衡、免疫机能低下等多种疾病的发生[2-4]。随着生物医学技术的发展，微量元素硒已经引起人们的高度重视。硒的补充主要通过无机硒及有机硒2种方式，而无机硒对人体有一定的毒性，故主要采用有机硒的补充方式[5]。酵母菌能够在细胞内将无机硒取代含硫氨基酸中的硫，生成硒代氨基酸，从而将无机硒转化为有机硒，消除有机硒的毒害作用。因此酵母硒具有更易为机体吸收、利用性高、安全性强等优势[6-7]。因此，富硒酵母是營养功能更全面的有机硒补充剂。临床试验证明，通过服用富硒酵母可以提高血浆中的硒含量，并能有效降低癌症的发生率和死亡率[8]。

研究报道，富硒酵母在培养过程中，亚硒酸钠的添加量、添加时间、培养基组成等因素对酵母细胞的细胞浓度、富硒量等均有明显的影响[9]。因此，笔者从实验室保存的众多酵母菌株中筛选耐受亚硒酸钠强的菌株为出发菌株，研究该菌株在培养过程中的亚硒酸钠添加量、添加时间、酵母菌接种龄、培养温度等参数，从而使酵母的生物量及富硒量达到最优。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。酿酒酵母（Sacharomyces cerevisiae）菌株均由徐州工程学院食品生物工程实验中心分离保存。

1.1.2培养基。

种子培养基：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母膏1.0%。固体培养基添加琼脂1.5%。

发酵培养基：葡萄糖4.0%，蛋白胨1.5%，牛肉膏2.0%，硫酸铵0.5%，磷酸氢二钾1.0%，pH 6.0。

1.1.3仪器与试剂。

仪器：UV-1750紫外分光光度计，日本岛津公司；SIGMA-3k15台式高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；THZ225大容量恒温振荡器，太仓市华美生化仪器厂。

试剂：亚硒酸钠、浓硝酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、甲酸、甲苯、3，3-二氨基联苯胺（DAB）、甲酸、氟化钠、95%乙醇，均为分析纯；消化液为浓硝酸∶高氯酸=4∶1（V/V）。

1.2方法

1.2.1硒含量的测定方法。

1.2.1.1标准曲线的制作。

用体积百分比50%盐酸溶液溶解亚硒酸钠，至浓度为1 μg/mL，得到标准硒溶液。吸取以上标准硒溶液0、5、10、15、20、25 mL于50 mL烧杯中，加无菌双蒸水至35 mL，加入2 mL 0.1 mol/l EDTA-2Na，各加5 mL质量分数0.5% 3，3-二氨基联苯胺（DAB）溶液，用甲酸调pH为2.0～3.0，反应30 min，再用质量分数5%的NaOH调节pH至6.0～7.0，转入分液漏斗，加入10 mL甲苯萃取，分离甲苯部分，紫外分光光度计于420 nm波长处测定吸光度，以OD值为横坐标，硒含量为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.1.2细胞内硒含量的测定。

准确称取干燥菌体置于烧杯中，加入消化液，通风橱内用电炉缓慢加热进行消化，将消化好的样品加入35 mL蒸馏水，然后加入2 mL 0.1 mol/l EDTA-2Na，0.2 mL 4%氟化钠；调节pH 2.0～3.0，加入0.5% 3，3-二氨基联苯胺2 mL反应30 min。NaOH调pH至6.0～7.0，转入分液漏斗，加入甲苯萃取，用752紫外分光光度计测定甲苯部分，根据标准曲线计算菌体中有机硒的含量。

1.2.2生物量的测定。

将待用离心管编号，烘干后称重，记录空管质量，然后将培养好的酵母液倒入离心管中，6 000 r/min离心8 min收集菌体，蒸馏水洗涤3次，以除去杂质，再于55～60 ℃下烘干至恒重，称重，前后两次之差即为酵母生物量即。

1.2.3酵母菌的硒耐受性筛选[10]。

接种环分别从保存的斜面酵母菌株试管挑取一环菌至酵母菌液体培养基中，于27～30 ℃条件下振荡培养18 h，然后再次按照10%的接种量，取以上培养的酵母菌液接种至新的酵母菌液体培养基中，相同条件下继续活化培养。取活化好的菌液无菌水稀释100倍，吸取100 μL，涂布于含亚硒酸钠浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL的平板上，28 ℃培养48 h后观察菌落颜色变化，选取在高浓度亚硒酸钠平板上红色的酵母菌落作为亚硒酸钠高耐受菌株。选择耐受性较强的菌株再进行液体发酵试验，测定菌体生物量及富硒含量，选取富硒含量最高的菌株作为优化目的菌株。

1.2.4不同硒添加量对富硒效果的影响。

将酵母菌株FX5于种子培养基中培养至18 h，然后按照10%接种量接种至液体发酵培养基培养基中培养至20 h，加入亚硒酸钠，使发酵液中亚硒酸钠的质量浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，30 ℃，180 r/min培养60 h后收集并干燥菌体，测定菌体的生物量和硒含量，分析不同加硒量对富硒效果的影响。

1.2.5不同加硒时间对酵母含硒量的影响。

设计7个不同加硒时间，分别在0、2、4、6、8、10、12 h时加入亚硒酸钠至终浓度20 g/L，装液量50 mL/250 mL，30 ℃，180 r/min下恒温培养，60 h后分析不同加硒时间对酵母菌生物量及富硒量的影响。

1.2.6温度对硒酵母生物量和含硒量的影响。

设定发酵温度为18、20、22、24、26、28、30、32 ℃下培养60 h，接种量10%，最终硒浓度为20 g/L，装液量50 mL/250 mL，30 ℃，180 r/min下恒温培养，60 h后分析培养温度对酵母菌生物量及富硒量的影响。

1.2.7培养基初始pH对硒酵母生物量和含硒量的影响。

将发酵培养基初始pH设置为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、75、8.0，加入亚硒酸钠至终浓度20 g/L，装液量50 mL/250 mL，30 ℃，180 r/min下恒温培养，60 h后分析初始pH对酵母菌生物量及富硒量的影响。

1.2.8转速对硒酵母生物量和含硒量的影响。

分别以100、120、140、160、180、200、220 r/min的转速，加入亚硒酸钠至终浓度20 g/L，装液量50 mL/250 mL，30 ℃恒温培养，60 h后分析初始搖床转速对酵母菌生物量及富硒量的影响。

1.2.9接种菌龄对硒酵母生物量和含硒量的影响。

分别接种菌龄为36、48、60、72、84、96、108 h的种子菌，加入亚硒酸钠至终浓度20 g/L，装液量50 mL/250 mL，30 ℃、180 r/min恒温培养，60 h后分析接种菌龄对酵母菌生物量及富硒量的影响。

2结果与分析

2.1酵母菌的耐受性及富硒效果比较

采用酵母菌对亚硒酸钠的抗性测定进行筛选，测定了50株酵母菌对亚硒酸钠的抗性，结果表明不同酵母菌株对亚硒酸钠的抗性不同。选出对亚硒酸钠抗性较高、菌落较大、颜色较浅的酵母菌进行纯培养，经过多次划线纯化后，得到9株菌株（表1），其中FX5菌株生物量及富硒含量最高，以该菌进行发酵培养条件优化。

2.2硒添加量对富硒效果的影响

从图1可以看出，随着亚硒酸钠的增加硒含量逐渐增加，达20 g/L时，继续增加硒含量反而降低。可能的原因是在没有加入硒时，培养液中硒含量较低，不利于酶的合成，加入适量硒后，促进了相关酶的合成，从而使含硒量提高。但是从图1中的结果可以看出，当硒浓度超过20 g/L后，酵母菌中硒含量随着亚硒酸钠的添加浓度的增加不再增长，而是减小，很有可能是当硒浓度进一步增加时，抑制了相关酶的合成。故选取20 g/L为最佳加硒量。

2.3不同加硒时间对酵母菌含硒量的影响

由于菌体在不同时间段内其生理状况不同，所以在不同的时间段加入硒，菌体的最终含硒量不同。由图2可见，随着硒加入时间的不同，酵母菌含硒量有很大变化。在发酵培养6 h加入亚硒酸钠可以明显减弱环境对酵母生长的抑制，促进菌体数量增加的同时，更有利于酵母对无机硒最大限度地吸收和转化。故培养6 h是最佳的加硒时间。

2.4温度对硒酵母生物量和含硒量的影响

如图3所示，在发酵温度低于28 ℃时，随着发酵温度升高菌体生物量逐渐增加。因为在低温条件下菌体需要合成更多的多不饱和脂肪酸以维持细胞膜的流动性。但在发酵温度较高的情况下富硒能力下降明显。由3图可知，在28 ℃时菌体生物量及富硒含量最高。

2.5培养基初始pH对硒酵母生物量和含硒量的影响

pH是影响微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数，是代谢活动的综合指标，培养基初始pH对菌株生长和含硒量具有重要影响，环境pH直接影响着细胞膜的活性、稳定性以及产物代谢酶系的活性，从而间接影响着微生物对营养物质的吸收和酶的分泌。如图4所示，初始pH 6.0时，菌株富硒量最高，生物量也最大；pH 4.5～6.0时，硒含量逐渐增加。综合考虑，最佳的初始pH为6.0。

2.6转速对硒酵母生物量和含硒量的影响

调节转速是酵母摇瓶发酵过程中控制溶解氧的主要方式，而溶解氧对酵母的生长和繁殖均有重要作用。由图5可知，随着摇瓶转速的提高，溶氧浓度加大，菌体干重和含硒量呈明显上升趋势，当摇床转速达160 r/min，菌体干重和含硒量已达到最大值；当摇床转速大于160 r/min 时，菌体干重和含硒量呈下降趋势。说明再增加通气量会导致细胞呼吸强度加大，细胞生长速度过快而影响含硒量。因此，该试验选择摇床转速160 r/min。

2.7接种龄对硒酵母生物量和含硒量的影响

接种菌龄直接决定接入发酵培养基的菌体活跃度，因此对菌体生长有一定影响，进而会影响菌株的生长和含硒量。该研究中针对不同接种菌龄对菌体生长和富硒的影响进行了探索，分析了接种菌龄为36、48、60、172、84、96、108 h时菌株的发酵情况，结果见图6。随着接种菌龄的增加，菌体干重和含硒量先增加后减小，接种菌龄为84 h时，菌体干重和含硒量达到最高。

以优化后的各个参数进行酵母发酵培养试验，结果显示，酵母菌体干重达40.1 g/L，含硒量达1 120 mg/L。

3结论

酿酒酵母在含有无机硒的环境中培养可以将无机硒转化为有机硒。但是菌株的生长及有机硒的转化能力同时又受到初始硒浓度、接种菌龄、培养温度等诸多因素的影响。其中培养基中的初始硒浓度对酵母菌的影响则较大，当浓度超过一定范围时，酵母菌的生长代谢受到强烈的抑制，不利于其对硒的富集。该研究以实验室保藏的酿酒酵母为出发菌株，通过将活化好的菌株接种于不同浓度的亚硒酸钠平板上，再通过进一步的液体发酵复筛，得到一株生物量及富硒含量较高的菌株FX5。该酵母菌的最适硒浓度为20 μg/mL，酵母将无机硒转化为有机硒的最佳培养条件：初始硒浓度20 μg/mL，接种量10%，装液量50 mL/250 mL，温度28 ℃，初始pH 6.0，摇床转速160 r/min，培养60 h。在优化后的富硒发酵条件下进行酿酒酵母的发酵试验，其生物量达40.1 g/L，富硒量为1 120 mg/L。酵母在此最佳培养条件下有着较高的有机硒转化率，为发酵罐放大培养奠定基础，因此存在广阔的应用前景。

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