可得然胶高产菌株的亚硝基胍诱变育种及其发酵条件的优化

王钦　靳晓菡　牛宝琳　阮宽容　陆泽赟　金明飞　常忠义　高红亮

摘要[目的]研究用亚硝基胍（NTG）对产可得然胶菌株进行诱变育种及发酵条件优化，为可得然胶产量提升的研究提供参考。[方法]以土壤杆菌HS615（Agrobacterium sp.）为出发菌株，通过NTG诱变筛选高产菌株，再利用单因素和正交试验设计优化发酵培养基，提高得率。[结果]根据致死率确定了NTG的诱变条件为0.5 mg/mL，NTG处理30 min。其次根据菌落颜色和大小确定了初筛平板培养基为1.0%葡萄糖，0.2%酵母粉，0.05%苯胺蓝，初始pH为7.0。经过NTG诱变得到1株可得然胶得率比出发菌株高11.79%的高产菌株。单因素和正交试验设计优化发酵培养基成分为11.0%蔗糖，0.3%玉米浆，0.2% KH2PO4，0.2%K2HPO4，0.2%NH4Cl，0.2%CaCO3，0.1% MgSO4·7H2O，此时可得然胶得率为5.67%，比优化前提高了6.78%，比初始产量提高了19.37%。[结论]该研究可为可得然胶高产菌株筛选及发酵条件优化提供参考依据。

关键词土壤杆菌；可得然胶；诱变育种；发酵

中图分类号TQ920.6文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0083-04

Mutagenesis Breeding of Nitrosoguanidine and Optimization of Fermentation Conditions in High Yield Strain of Curdlan

WANG Qin， JIN Xiaohan， NIU Baolin，GAO Hongliang* et al

（College of Life Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241）

Abstract[Objective]To study the mutagenic breeding and fermentation conditions optimization of the strain producing guar gum by NTG， and to provide reference for the study of the increase of available gum yield. [Method] The strain was screened by Agrobacterium sp. HS615 （Agrobacterium sp.）， And the fermentation medium was optimized by single factor and orthogonal design. [Result]The mutagenic conditions of NTG were determined to be 0.5 mg/mL and NTG for 30 min. Followed by the colony color and size of the screening medium was identified as： 1.0% glucose， 0.2% yeast powder， 0.05% aniline blue， the initial pH of 7.0. A strain with high yield of Curdlan was 11.79% higher than that of the original strain. The single factor and orthogonal design optimized fermentation medium components were： 11.0% sucrose， 03% corn steep liquor， 0.2% KH2PO4， 0.2% K2HPO4， 0.2% NH4Cl， 0.2% CaCO3， 0.1% MgSO4·7H2O at this time Curdlan yield Was 5.67% higher than the preoptimization of 6.78%， compared with the initial yield increased by 19.37%.[Conclusion] This study can provide a reference for the selection of Curdlan high yield strains and optimization of fermentation conditions.

Key wordsAgrobacterium sp. ；Curdlan；Mutation breeding；Fermentation

可得然膠多糖（Curdlan）又称为热凝胶多糖，是由单一的D-葡萄糖在 C1和C3位置以β-1，3-糖苷键连接而成的无分支的均一多糖聚合物[1]。由于其具有独特的热成胶性质，被用于食品中作为稳定剂、增稠剂和调质剂使用[2]；同时可得然胶由于其独特的大分子结构及特殊的三股螺旋高级立体分子构造[3]，经过修饰后还具有良好的生物活性，可以应用于医药领域，起抗肿瘤、预防癌症、治疗疟疾以及抗凝血等作用[4-8]。因此，可得然胶在食品医药工业中具有广阔的应用前景。

提高可得然胶产量的关键是获得高性能的生产菌株。在微生物育种中，利用亚硝基胍（NTG）化学诱变剂处理菌株是常用的诱变方法。为有效快速地分离出高产菌株，该研究利用苯胺蓝平板进行菌株显色筛选。苯胺蓝是一种分子结构稳定的酸性染料[9]，可得然胶中的β-1，3键与其结合具有特异性[10-11]，能产生蓝色复合物，且蓝色复合物的合成率与聚合物浓度相关。因此苯胺蓝平板显色法将会是筛选产微生物多糖菌株的优良方法。笔者用NTG对1株土壤杆菌HS615（Agrobacterium sp.）进行化学诱变，将诱变后的菌液涂布在苯胺蓝平板上进行初步筛选后，在摇瓶中进行发酵培养，粗提产物测其得率，以此筛选出1株性能稳定的高产菌株，并对发酵培养基进行优化，以进一步提高其产量，为可得然胶的工业化生产奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。

华东师范大学生命科学学院微生物与食品安全实验室保藏的土壤杆菌HS615 （Agrobacterium sp.HS615）。

1.1.2主要试剂。

葡萄糖、苯胺蓝、酵母粉、琼脂粉、聚蛋白胨、酵母粉、 NaCl、（NH4）2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、酵母膏液。

1.1.3主要仪器。

隔水恒温培养箱（GNP-9160），上海精宏；全温恒温培养摇床（QZQY-BF），知楚仪器；冷冻离心机（RC6PLUS），Thermo；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9246A），上海精宏。

1.1.4培养基。

苯胺蓝筛选基础培养基：葡萄糖7.00%、苯胺蓝 0.05%、酵母粉0.20%、琼脂粉 2.00%，pH 7.0。

PY培养基：多聚蛋白胨1.0%、酵母粉 0.5%、 NaCl 0.5%，pH 7.2。

发酵基础培養基：蔗糖9.0%、（NH4）2HPO40.2%、 KH2PO4 0.2%、 MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO30.2%、酵母膏液0.4%，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1诱变。

1.2.1.1制备菌悬液。

将出发菌株在PY培养基中30 ℃ 200 r/min 摇床培养20 h，菌液离心后用生理盐水重悬后备用。

1.2.1.2菌株诱变。

用pH 8.5的0.2 mmol/L Tris-马兰酸缓冲液溶解 NTG，并制备不同浓度NTG加入到备用菌悬液中，用锡箔纸包裹避光，并于30 ℃ 200 r/min 摇床处理不同诱变时间。处理结束后加入500 μL硫代硫酸钠溶液终止反应，并用生理盐水重悬。

1.2.2筛选。

1.2.2.1诱变菌株平板筛选。

在苯胺蓝平板上加入100 μL不同稀释度的诱变菌液涂布均匀后30 ℃恒温培养。

1.2.2.2摇瓶发酵筛选。

苯胺蓝平板上挑取蓝色较深、菌落较大的菌株进行划线分离，单菌落扩配后接种到50 mL锥形瓶，30 ℃、250 r/min 摇床培养96 h，测定可得然胶得率。

1.2.3可得然胶得率测定。

称取10 g发酵液于离心管中，9 000 r/min离心5 min。倒去上清液后加入20 mL 95%的乙醇，9 000 r/min离心5 min，倒去上清后将沉淀取出置于培养皿中，放置于60 ℃烘箱中过夜，干燥后称重即为可得然胶得率。

1.2.4数据分析及处理。

采用Excel、SPSS统计软件进行数据处理，以P<0.05为有显著性。采用GraphPad prism 5.0 进行图表绘制。

2结果与分析

2.1NTG诱变条件的确定

2.1.1NTG诱变剂量。

该研究以108 CFU/mL的菌体浓度进行诱变试验，选取了0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mg/mL 6

个剂量，诱变30 min，结果如图1所示。NTG为0.1 mg/mL

时，致死率仅为65%；为0.5 mg/mL时，致死率为98%；NTG 0.7和1.0 mg/mL时致死率已接近100%。因此，该试验选取0.5 mg/mL的NTG浓度进行诱变。

2.1.2NTG诱变时间。

以0.5 mg/mLNTG剂量，分别诱变20、30、40、50 min。由图2可见，当处理时间分别为20和30 min时，菌株的致死率分别为90.8%和99.0%，而处理时间为40和50 min时致死率已接近100%。

根据致死率情况最终确定NTG诱变剂量为0.5 mg/mL，诱变时间为30 min。

2.2苯胺蓝筛选培养基的优化

由于可得然胶含有β-1，3-糖苷键，可被苯胺蓝特异性地染成蓝色[12]，有利于平板初筛。培养基中氮源和碳源浓度均会影响菌落的大小和显色的时间，因此优化了筛选培养基配方中的氮源酵母粉和碳源葡萄糖。

2.2.1氮源的优化。

在培养基中添加0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的酵母粉，其他成分同苯胺蓝筛选基础培养基，涂布诱变后的菌株培养 96 h后进行观察。如图3所示，平板中部分区域显示蓝色，随着酵母粉浓度的增加，菌落显色面积减小。这是由于土壤杆菌培养基中氮源耗尽后才开始产胶，氮源浓度越低，产胶越早，显色越早。但随着酵母粉浓度的减小，菌落也随之减小，因此该试验选择0.2%的酵母粉浓度。

2.2.2碳源的优化。

在苯胺蓝筛选培养基中，酵母粉固定为0.2%，葡萄糖浓度分别为1.0%和7.0%时，培养96 h结果见图4。菌落的大小差异不大，但1.0%浓度的葡萄糖可以有效减缓平板底板变蓝的效应，因此选择1.0%的葡萄糖浓度。最终确定苯胺蓝筛选平板的酵母粉浓度为0.2%，葡萄糖浓度为1.0%。

2.3NTG对土壤杆菌的诱变

2.3.1NTG诱变菌株的初筛。

出发菌株HS615经NTG诱变后，稀释涂布平板，共涂布约10 000株菌，挑选菌落蓝色且偏大的突变菌株287株，接种于斜面培养24 h，之后刮取一环接种于摇瓶发酵初筛，结果如图5所示。出发菌株得率为437%，其中可得然胶得率超过出发菌株5%的菌株有15个，超过出发菌株10%的菌株有7个，超过出发菌株15%的菌株有1个，其中170221-16#菌株得率最高，为5.03%。

2.3.2NTG诱变菌株的复筛。

对初筛得率高于出发菌株5%的菌株进行再次摇瓶发酵复筛，可得然胶得率如图6所示，出发菌株得率为4.43%，其中3株得率较出发菌株涨幅超过10%，其中170221-16#得率为504%，161125-47得率为501%，161021-13得率为4.98%。

将3株高产菌株甘油管保种于-80 ℃，再对其进行摇瓶发酵验证。

将菌液接入种子培养基进行活化，再用二级种子液进行摇瓶发酵。出发菌株可得然胶得率为4.75%，诱变菌株170221-16#得率最高为5.31%，比出发菌株得率提高1179%。以16#菌株为试验材料，进行发酵培养基优化试验。

诱变所得高产菌株16#在筛选平板中表现为显色较早、颜色较深、形态较大的菌落。其菌落边缘呈褶皱状、不光滑，中间光滑突起，如图7所示。

2.4诱变菌株16#发酵培养基优化

2.4.1碳源种类对发酵的影响。

设定碳源分别为蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖，浓度皆为9%，其他成分为发酵基础培养基，摇瓶发酵96 h，发酵结果如图8所示。蔗糖作为碳源时产胶量最高，达5.35%；其次为麦芽糖，发酵可得然胶得率为4.74%；葡萄糖和乳糖作为碳源时的产胶量最低。因此该试验选择蔗糖作为发酵培养基的碳源成分。

2.4.2有机氮源种类对发酵的影响。

设定有机氮源为玉米浆、酵母粉902、酵母粉802、蛋白胨350、蛋白胨321、蛋白胨326、蛋白胨410，浓度皆为0.4%，其他同基础发酵培养基，摇瓶发酵96 h，发酵结果如图9所示。玉米浆作为有机氮源可得然胶得率最高，达5.49%，且明显高于其他有机氮源。因此该试验选择玉米浆作为发酵培养基的有机氮源成分。

2.4.3磷酸盐缓冲对配比对发酵的影响。

磷酸盐缓冲对在调节发酵液pH方面有着重要作用。土壤杆菌的最适产胶pH为5.5～5.6，菌体生长的适宜pH在7.0[13-14]。原基础发酵培养基中缓冲对为（NH4）2HPO4和KH2PO4，若是改变缓冲对浓度会同时改变培养基中的无机氮源浓度，故将（NH4）2HPO4替换为等浓度的NH4Cl和K2HPO4。然后改变KH2PO4和K2HPO4浓度，二者均为0.05%、0.1%、0.2%、05%、1.0%，摇瓶发酵96 h，发酵结果如图10所示。0.2%的磷酸盐浓度可得然胶得率最高，达到5.63%。因此该试验选择0.2%为发酵培养基中磷酸盐缓冲对的浓度。

2.4.4培养基成分正交试验分析。选取碳源、氮源、磷酸盐缓冲对浓度为培养基的影响因素，以可得然胶得率为指标，考察各因素对得率的影响。正交试验因素水平设计见表1，结果见表2。

根据正交试验结果，选取得率最高组和k值最高组再次进行发酵验证试验。结果显示，前者可得然胶得率为554%，后者得率为5.67%。因此，获得最佳的培养基成分为11.0%蔗糖，0.3%玉米浆，0.2% KH2PO4，02%K2HPO4，0.2%NH4Cl，02%CaCO3，0.1% MgSO4·7H2O。和优化前的培养基相比，可得然胶得率提高了6.78%。

3结论

以实验室保存土壤杆菌HS615为出发菌株进行NTG诱变，根据致死率确定诱变剂量为0.5 mg/mL，诱变时间为30 min。對苯胺蓝筛选培养基进行优化，选择出显蓝色最早且菌落形态较大的培养基酵母粉和葡萄糖浓度分别为0.2%和1.0%。以优化后的苯胺蓝培养基进行NTG诱变和平板筛选，获得产胶菌株，并对产胶菌株进行摇瓶发酵初筛和复筛，最终获得1株性能稳定的高产菌株16#。进一步对高产菌株进行发酵的碳源、氮源种类以及磷酸缓冲对的配比进行优化，获得最优碳源为蔗糖，有机氮源为玉米浆，磷酸缓冲对最佳配比为0.2%。在此基础上进行正交试验，获得最佳的培养基成分：11.0%蔗糖，0.3%玉米浆，0.2% KH2PO4，02%K2HPO4，02%NH4Cl，0.2%CaCO3，0.1% MgSO4·7H2O。

通过对正交试验结果分析可知，磷酸盐缓冲对浓度对试验结果的影响最为显著，是影响发酵得率的重要因素。在单因素试验中，磷酸盐缓冲对浓度的优化结果使得高产菌株得率提高了6.03%，相较于出发菌株得率提高18.53%。在发酵生产中提供一个适宜的缓冲体系来满足可得然胶生产过程中菌体生长和产胶2个阶段不同的pH要求，这为以后的放大培养优化发酵过程，提高可得然胶的产量开辟了新的思路。

该试验通过对苯胺蓝筛选培养基优化，直接从筛选平板上挑出优势菌株，简化了筛选方法。并且筛选到了1株高产菌株16#，比出发菌株可得然胶得率提高了11.79%，进一步通过优化培养基配方，可得然胶得率进一步提高了6.78%，相较于最初得率提高了19.37%，达到了工业化水平。查阅文献可知，近年来可得然胶摇瓶发酵得率处于4.5%左右[1，15-16]，有文献表明经过发酵优化得率达到4.73%[17]。该试验所筛选出的高产菌株得率为5.67%，相较于文献中菌株得率提高19.87%。这一试验结果为可得然胶的工业化生产奠定了基础。

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