适用于转录组测序的大豆根总RNA的提取方法研究

谢钰珍　覃鸿妮　张宇

摘要[目的]獲得高质量、高产量并能满足转录组测序要求的大豆根总RNA。[方法]比较分析了Trizol法、CTAB-LiCl法和试剂盒法的提取效果。[结果]3种方法均能从大豆根中提取出总RNA。但与Trizol法、CTAB法相比，试剂盒法提取的大豆根总RNA纯度高、完整性好，平均浓度达413.9 ng/μL，A260/A280≈2.14，A260/A230≈2.10，方法可重复性好。[结论]试剂盒法提取的RNA满足转录组测序的质量要求，可进行后续的转录组测序和其他分子生物学相关研究工作。

关键词大豆；根；总RNA；转录组测序；提取方法

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）36-0137-03

Abstract[Objective] To obtain total RNA from soybean roots with high quality，high yield and to meet the transcription group sequencing requirements.[Method]Three extracting effects were compared，including Trizol reagent，CTABLiCl method and Kit method.[Result] All three methods can extract total RNA from soybean.However，the extraction kit was the best with high purity and integrity RNA.The average concentration was 413.9 ng/μL，A260/A280 was approximately 2.14，A260/A230 was 2.10 by using extraction kit，which was repeatable.[Conclusion]The RNA extracted by Kit method meets the quality requirements for transcriptome sequencing and can be used for subsequent RNAseq and other molecular biologyrelated studies.

Key wordsSoybean；Root；Total RNA；RNAseq；Extraction method

从植物组织中提取质量高、纯度高、完整性好的RNA是植物分子生物学研究的基本技术之一。近年来，高通量测序技术得到突飞猛进的发展，在此基础上，RNA-seq技术也越来越受到人们的关注，获取高质量的总RNA成为测序成功的基石[1]。大豆作为常见豆科植物，其多酚、多糖类物质含量丰富，RNase活性高，RNA提取难度大，尽管目前关于大豆总RNA提取的研究较多，但通过这些方法提取的RNA只适用于后期的RT-PCR等试验，直接用于转录组测序少见报道[2-6]。该试验以大豆根为材料，选取3种常用方法提取其总RNA，根据琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计以及Agilent 2100检测结果，比较分析各方法的提取质量，以期找到一种能满足转录测序要求的大豆根总RNA的提取方法，为转录组测序及相关分子生物学研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料采集大豆的幼嫩根尖，液氮冷却后，-80 ℃保存备用。

1.2主要试剂及耗材CTAB提取液：2% CTAB，2% PVP，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl，β-巯基乙醇（使用前加入）；Trizol（美国Life公司）；Aidlab EASYspin Plus多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒（北京Aidlab公司）；SSTE buffer：1 mol/L NaCl，0.5% SDS，10 mmol/L EDTA，DEPC水；10×DNase assay buffer（美国USB公司）、RNase inhibitor（美国Omega公司）、DNaseⅠ（德国QIAGEN公司）；无水乙醇、氯仿、异丙醇、75%乙醇、4 mol/L LiCl、3 mol/L NaAc、DEPC水；1.5 mL无核酸酶离心管（美国Axygen公司）。

1.3大豆根总RNA的提取

1.3.1CTAB-LiCl法。

65 ℃预热15 mL CTAB提取液（加入300 μL β-巯基乙醇）；取100 mg冷冻（-80 ℃）的大豆根组织，迅速放入液氮研磨至粉末状；

转移粉末至1.5 mL离心管中，加入700 μL预热过的CTAB提取液，涡旋混匀，65 ℃温浴15 min；加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），颠倒混匀，4 ℃、10 000 r/min离心15 min；取上清，重复抽提1次；转移上清至新的离心管，加入等体积4 mol/L LiCl，使LiCl的终浓度为2 mol/L，混匀后4 ℃过夜沉淀；4 ℃、15 000 r/min离心1 h，弃上清， 75%乙醇清洗沉淀2次；置于超净工作台晾干，加入500 μL SSTE溶解沉淀；

加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）再抽提1次；加入1/10体积的NaAc，二倍体积的无水乙醇，-20 ℃沉淀2 h；4 ℃、15 000 r/min离心20 min，弃上清，75%乙醇清洗沉淀2次；于超净工作台晾干后，加入65 μL DEPC水溶解RNA；

加入10×DNase assay buffer 7.5 μL、RNase inhibitor 1.0 μL、DNase Ⅰ 1.5 μL，37 ℃水浴20 min；

加入DEPC水调整样品体积至250 μL，加入1/10体积3 mol/L NaAc，颠倒混匀；

加入二倍体积冷的无水乙醇，混匀后-20 ℃放置30 min；4 ℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清，75%乙醇清洗沉淀2次；于超净工作台晾干后，加入50 μL DEPC水完全溶解，-70 ℃保存待用。

1.3.2Trizol法。取100 mg左右大豆根组织，迅速放入液氮研磨至粉末状；转移粉末至装有1 mL Trizol裂解液的1.5 mL离心管中，涡旋振荡，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清至新的离心管，加入等体积氯仿，涡旋振荡，冰上静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；小心吸取上清至新的离心管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀，冰上静置20 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；弃上清，75%乙醇清洗1～2次，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；弃上清，4 ℃、12 000 r/min离心1 min，吸弃残留液体，冰上放置，于超净台内晾干；加入70 μL DEPC水溶解沉淀，-70 ℃保存待用。

1.3.3试剂盒法。

采用Aidlab EASYspin Plus多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒，具体操作步骤参见该产品说明书。

1.4RNA的质量检测

1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性，紫外凝胶成像仪观察并拍照；NANODROP 2000超微量分光光度计检测RNA的纯度及浓度；Agilent 2100生物分析仪深度检测RNA质量。

2结果与分析

2.1大豆根总RNA的完整性与纯度分析

琼脂糖凝胶电泳（图1）表明，3种方法均提取出了总RNA。Trizol法提取的RNA 5S亮度偏高，显示样品有降解；CTAB-LiCl法提取的RNA 5S亮度适中，但条带拖尾且有轻微DNA污染；试剂盒为吸附柱法，无法吸附200 bp以下的片段，所以此法提取的总RNA无5S条带，但18S和28S条带完整，无拖尾、弥散现象，亮度明显高于另外2种方法。28S条带的亮度约为18S的2倍，说明RNA完整性较好，产率高。

2.2大豆根总RNA的质量及浓度分析

紫外分光光度计测定结果（表1）表明，试剂盒提取的RNA浓度最高，纯度最好，平均浓度为413.9 ng/μL，A260/A280≈2.14，A260/A230≈2.10。另外2种方法提取的RNA A260/A280虽然也在1.80～2.10，但A260/A230过低，远小于2.00，说明RNA里含糖类和酚类杂质较多。

应用Agilent 2100生物分析仪是RNA样品质量控制的行业标准，可通过RNA完整值（RIN值）来确定RNA的质量。Trizol法中3个样品的RIN值远小于10.0，说明RNA降解严重，完整性差。CTAB-LiCl法中3个样品RIN值分别为9.9、9.8和9.8，RIN值接近10.0，样品完整性高。但18S和28S峰形面积比都在3左右，说明样品的18S峰左右有碱基信息丢失。试剂盒提取的RNA RIN值均为10.0，18S和28S峰形面积比基本在2左右，峰形完美，无碱基信息丢失，说明样品完整性高，在质量上达到文库构建和转录组测序的要求。

2.3高通量测序结果

综合上述结果，试剂盒提取的RNA在质量上达到文库构建和转录组测序的要求，遂寄交公司进一步检测后建库开展测序。

根据高通量测序结果数据质量统计，送检的RNA混合样品Q20（Phred数值大于20的碱基占总体碱基的百分比，即错误率<1.0%）

和Q30（Phred数值大于30的碱基占总体碱基的百分比，即错误率<0.1%）的比例分别达92.17%和84.29%，说明测序过程中数据错误率较低。GC碱基含量达51.29%，十分接近50.00%，说明RNA样品的碱基对平衡，数据完整性高。另外，此测序过程中无法确定的碱基信息低于每百万1.83的比例，说明测序中很少或没有无法确定碱基信息的reads。综上所述，试剂盒提取的RNA高通量测序的结果准确率高，适合后续的生物信息学分析。

3结论与讨论

高通量测序就是运用基因组DNA或RNA经过修饰，建立文库，之后上机测序。核酸的质量决定了建库的成果和测序数据的准确性。转录组测序就是利用高通量测序平台对物种的转录组水平进行深度测序，转录组研究是从整体水平研究基因功能以及基因结构。

RNA-seq技术对RNA质量要求较高：植物样本RNA浓度≥50 ng/μL、总量≥2 μg、A260/A280≥2.0、A260/A230>1.8、28S/18S≥1、RIN值≥6.5。大豆作为常见的豆科植物，组织中富含多糖、多酚类物质。细胞破碎后多酚类化合物极易被氧化成红褐色物质，并与核酸不可逆结合；多糖的理化性质与RNA非常相似，提取时很难将二者区分开来。加之RNA极不稳定，易被降解[7]，更增加了从大豆中提取高质量RNA的难度。

近年来，关于大豆根总RNA的提取虽有不少报道，如异硫氰酸胍法[3]、改良Trizol法[2]对其提取效果均不错，但通过这些方法提取的RNA并不符合转录组测序的质量要求。因此，找到一种能够满足转录组测序质量要求的RNA提取方法非常重要。

该试验以前人研究为基础，分析比较了Trizol法、CTAB-LiCl法和试剂盒法3种方法提取大豆根总RNA的效果。Trizol法方便省时，通过成分中的苯酚和异硫氰酸胍直接裂解细胞，同时还能一定程度地抑制RNA酶活性，但此法不能有效去除植物的多糖、多酚，所以提取的RNA杂质较多且有降解，RNA质量差；CTAB法和试剂盒法提取的RNA完整性好，基本无降解。前者价格相对便宜，但步骤繁杂、耗时较长，适合高校的实验室研究，不适用于正常的公司生产。此外，Agilent 2100检测结果显示，尽管获得的RNA RIN值接近10.0，样品完整性高，但3个平行样的18S和28S峰形面积比都为3左右，提示18S峰左右有碱基信息丢失，所以CTAB法提取的RNA不是进行高通量测序的最优选择。试剂盒的裂解液含植物RNA助提剂——PLANTaid，它可帮助结合多糖、多酚，并通过离心后去除，最后通过吸附柱特异性吸附核酸。此法提取的RNA产率高、纯度高，各方面均能满足高通量测序技术对RNA的质量要求。但试剂盒也有不足之处：①5S条带大概150 bp，吸附柱无法吸附200 bp以下的片段，所以该法提取的RNA凝胶电泳时无5S条带，此类RNA无法构建特殊的smallRNA 文库；②试剂盒法成本相对较高，实际应用时应酌情选择。综合各种因素，试剂盒法提取的RNA满足转录组测序的质量要求，可进行后续的转录组测序和其他分子生物学相关研究工作。

参考文献

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[7] 王文锋，穆灵敏，张光谋.富含多糖·多酚植物组织RNA的提取[J].安徽农业科学，2009，37（12）：5383，5417.