硫化氢在番茄耐受镉胁迫过程中的作用

程双妮 叶迦宁 金东宁 桂雪琴 张彦洁 刘旦梅

摘要[目的]研究硫化氢（H2S）在番茄耐受镉胁迫中的作用。[方法]采用5.0 mmol/L的镉溶液配合H2S和H2S生成抑制剂来处理番茄幼苗，研究H2S在番茄幼苗耐受镉胁迫的过程中对MDA、植物螯合肽编码基因、金属转运蛋白编码基因以及H2S生成基因表达的影响。[结果]镉胁迫促进番茄幼苗根尖细胞的死亡，镉浓度越高，其对番茄幼苗的氧化损伤越大；外源施加H2S会减轻镉胁迫所产生的氧化胁迫；同镉处理组相比，在同时施加H2S的处理组中，植物螯合肽编码基因、金属转运蛋白编码基因以及H2S生成基因的表达上调。 [结论] H2S可能通过提高植物螯合肽、金属转运蛋白以及H2S生成酶的表达来减轻重金属对番茄幼苗的损害。

关键词硫化氢；番茄；镉胁迫

中图分类号S601文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0140-04

Abstract[Objective] To study the function of hydrogen sulfide（H2S） in tomato under cadmium stress.[Method] We treated the tomato seedlings with cadmium solution （ 5.0 mmol/L） ， H2S and H2S generated inhibitors， then detected the content of MDA， as well as the expression levels of genes encoding andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S. [Result] Cadmium promoted the death of cells in root tips of tomato seedlings， the degree of damage improved as the concentration of cadmium increased. The oxidative stress was alleviated when H2S was applied. The expression of genes encoding andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S was upregulated when H2S was added to the treatments. [Conclusion] H2S can enhance the cadmium resistance of tomato seedlings by promoting the expression of andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S.

Key wordsHydrogen sulfide；Tomato；Cadmium stress

基金项目国家自然科学基金青年基金项目（31501772）。

作者简介

程双妮（1985—），女，山西晋城人，本科生，专业：生物工程。*通讯作者，副教授，博士，硕士生导师，从事植物分子生物学研究。

收稿日期2017-01-03

在生物体和细胞内存在着复杂多样的信号途径，在这些信号途径中，用来在细胞间和细胞内传递信息的化学分子称为信号分子。而在这些信号分子当中，气体信号分子在动植物正常生理和抵御逆境反应中起着非常重要的作用，并且由于其具有可连续发生、迅速传播以及快速弥散等特点而受到科学家们的广泛关注[1]。硫化氢（H2S）是近年来发现的第3种气体信号分子，虽然其研究起步较晚，但发展迅速[2]。人们发现在植物生长发育中，H2S能够促进种子的萌发和不定根的生成[3-4]；提高光合效率，促进植物的生长发育[5]；还可以延长切花的观赏期[6]。而在抵御非生物胁迫方面，H2S可以帮助植物抵抗干旱胁迫；增强植物对热胁迫的耐受性[7-9] 。现代工业的发展，在给人类带来大量便利的同时，也带来了严重的环境污染。这其中，重金属污染是危害较大的一类。在众多重金属当中，镉（Cd）是土壤污染中具有较大毒性的一类。当植物生长在镉污染的土壤中时，其生长发育会受到很大影响[10]。为应对重金属胁迫，植物在进化过程中已经驯化出一套灵敏且复杂的处理机制，这其中包括：①通过金属转运蛋白来控制重金属的转入和外排[11]；②通过金属硫蛋白和植物螯合肽的络合作用来减轻重金属的毒性[11-13]；③通过激活氧化还原系统来减轻重金属胁迫带来的氧化损伤[14-15]。已有研究表明，在植物遭遇重金属胁迫的同时对植物外源施加H2S可减轻重金属对植物的损伤[16]，但此类研究在番茄中鲜有报道。笔者通过H2S和Cd配合处理番茄幼苗，观察幼苗的氧化损伤并检测幼苗中H2S生成酶编码基因、金属转运蛋白编码基因以及植物螯合肽和金属硫蛋白编码基因的表达水平，探讨了H2S在番茄耐受镉胁迫过程中的作用。

1材料与方法

1.1材料

野生型番茄（Ailsa Criag）由番茄遗传资源中心（加州大学戴维斯分校）提供，选用发芽后培养5 d的番茄幼苗作为试验材料。番茄种子消毒过程如下：取适量种子置于20 mL离心管中，用1.5 mL 95%的乙醇洗2 min后倒去乙醇；加入1.5 mL 20%次氯酸鈉溶液（有效氯含量8%），摇床摇20 min；用无菌水清洗种子4～6次，每次清洗5 min；将消毒后的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿里，然后置于培养间发芽。

1.2方法

1.2.1

胁迫处理。番茄种子消毒洗涤之后置于湿润滤纸上发芽，待种子发芽后，转移至含有1/2 Hoagland营养液的培养皿中生长5 d，挑选长势一致的幼苗进行处理，用10 mL处理液（20 mmol/L CdCl2、100 μmol/L HT、1 mol/L NaHS，以及它们的稀释液或组合液）替换培养皿中的培养液。其中H2S处理采用熏蒸法，即将NaHS母液至于小盖子中并将该盖子至于培养皿中完成H2S处理。所有处理进行24 h后取样，分析数据。

1.2.2

MDA含量的测定。MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定。取0.15 g不同处理后的谷子幼苗，加入1.5 mL 5% TCA，研磨成浆，3 000 r/m离心5 min；取1 mL上清液，加1 mL 0.67% TBA沸水煮30 min，冷却；取1 mL上清液，分别在波长450、532和600 nm 处测上清液的吸光值并计算 MDA浓度。MDA含量（μmol/g）=MDA浓度（μmol/L）×提取液体积（L）/植物组织鲜重（g）。

1.2.3

内源H2S产率的测定。称取组织材料约0.2 g，按1〖DK〗∶10的比例加入提取液（0.05 mol/L PBS），充分研磨得到匀浆，4 ℃13 000 r/min离心10 min，取上清，用考马斯亮蓝法测定上清蛋白量；将L-Cys，Tris-HCl和DTT混合溶液置于小三角瓶中，放入加有500 μL的1%ZnAC的去盖EP管，将蛋白粗提液加入反应液中；空白对照用提取样液代替样品匀浆，其余条件不变，置于37 ℃摇床120 r/min反应15 min；将小三角瓶中的EP管拿出，分别在离心管中先后加入20 mmol/L DPD和30 mmol/L FeCl3各100 μL，颠倒混匀，置于室温暗处反应15 min；吸光度测定：在670 nm處测定吸光值，依据H2S产率标准曲线得到H2S浓度。H2S产率[nmol/（mg·min）]=H2S产生浓度（nmol/L）×0.7 L/[1.5 min×蛋白含量（mg）]。

1.2.4RNA提取和Real-time PCR。

取各处理中的番茄幼苗，利用RNAiso Plus试剂（TaKaRa）提取RNA，具体提取步骤按照试剂的使用说明。利用反转录试剂盒和Oligo（dT）进行反转录获得cDNA。以番茄ACTIN基因作为内参，分析各处理中相关基因的表达变化。用于Real-time PCR的引物见表1。每个试验重复3次，数据处理参见文献[17]。

2结果与分析

2.1镉胁迫对番茄幼苗的损伤分析

为研究镉胁迫对番茄幼苗的影响，利用不同浓度的镉来对番茄幼苗进行处理，并利用伊文思蓝染色来观察根尖细胞的死亡情况。结果表明，镉会导致番茄根尖细胞的死亡，并且随着镉浓度的升高，伊文思蓝染色越来越重（图1），说明死亡细胞的数目越来越多。同时对不同浓度处理的MDA含量进行了测定，结果表明随着镉浓度的增加，各处理番茄幼苗的氧化损伤也逐渐加大（图2）。镉浓度为5.0 mmol/L时毒害作用已经很明显，故后续试验镉浓度选择5.0 mmol/L。

2.2H2S参与番茄幼苗对镉胁迫的应答

为研究H2S在番茄幼苗耐受镉胁迫中的作用，对不同浓度镉处理下番茄幼苗中的H2S产率进行了分析。结果发现，随着镉浓度的升高，H2S产率也逐渐增高，说明当番茄幼苗面临镉胁迫时，H2S的生成被激发，暗示H2S参与番茄幼苗应答镉胁迫的过程（图3）。

2.3H2S缓解镉胁迫对番茄幼苗的损伤

上一步的结果表明H2S可能在番茄耐受镉胁迫过程中具有重要作用，为进一步证实此结论，利用外源H2S及其合成抑制剂HA同镉一起处理番茄幼苗，并对番茄幼苗的氧化损伤程度进行了分析，结果表明H2S处理可显著减轻番茄幼苗的氧化损伤程度，说明H2S可缓解镉胁迫对番茄幼苗的损伤，但是镉和H2S合成抑制剂HA一同处理时，幼苗的氧化损伤程度并没有增加，这可能是因为HA只抑制了H2S的合成，但番茄幼苗体内原来存在的H2S还是在一定程度上起到了保护作用（图4）。

2.4H2S缓解镉胁迫的机理分析

为进一步解析H2S缓解镉胁迫的分子机理，进一步对各处理中的植物螯合肽、金属硫蛋白、金属转运相关蛋白以及H2S生成酶编码基因的表达量进行了分析，结果表明：①镉处理后，植物螯合肽蛋白编码基因〖STBX〗SlPCS1的表达量明显下调，而当用H2S处理以后，〖STBX〗SlPCS1的表达量得以恢复并上调表达（图5）；②镉处理之后，金属转运蛋白编码基因〖STBX〗CEA、ZIP3和ZIP12的表达量不变或轻微上调，H2S处理以后，这些基因的表达量上调明显，但配合HA一起处理时，这些基因皆下调表达（图6）；③同金属转运蛋白一样，镉处理之后，番茄中的H2S生成酶编码基因轻微上调，但加入H2S后，这些基因的表达量上调明显，加入HA之后，这些基因的表达被显著抑制（图7）。上述结果表明，H2S可能通过调节番茄幼苗体内植物螯合肽、金属转运蛋白以及H2S生成酶的含量来帮助番茄幼苗抵御镉胁迫。

3结果与讨论

目前，重金属污染已经成为污染耕地，影响农产品质量的一个重要因素，研究植物耐受重金属胁迫的分子机理在生产上具有重要的应用价值。番茄作为一种具有经济价值的模式双子叶植物和茄科植物，有着遗传背景清晰、遗传转化容易的特点，并且其基因组已被测序，所以在番茄中研究重金属耐受机制，将为人们带来更多的分子水平的信息，并且这些工作也为番茄育种奠定了基础。

在该研究中，发现H2S在番茄耐受镉胁迫的过程中具有减轻其损伤的作用，其作用机制可能是通过提高金属螯合肽和金属转运蛋白的含量，加速镉在植物体内的螯合和转运速率，因而减轻重金属对植物的毒害作用力。同时在H2S的生成过程中，可能存在一个正向反馈机制，即外源施加H2S会导致内源H2S的合成增多，进而加快H2S的解毒过程。

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