前列通片促进免疫功能的实验研究

2017-05-30尹震吴燕梅吴钢

世界中医药 2017年6期

尹震吴燕梅吴钢

摘要目的：探讨前列通片对小鼠免疫功能的影响。方法：1）脾淋巴细胞转化试验：将60只小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组、前列通片低、中、高剂量组，每组12只。灌胃给药，1次/d，连续给药30 d后各组动物无菌取脾，提取脾淋巴細胞进行脾淋巴细胞转化试验。2）NK细胞活性影响试验：将60只小鼠随机分为阴性对照组、模型对照组、阳性对照组、前列通片低、中、高剂量组。除阴性对照组外，其余各组腹腔注射环磷酰胺建立免疫功能低下的小鼠模型。造模同时给药，连续给药30 d后，各组动物无菌取脾，提取脾淋巴细胞进行NK细胞活性影响试验。结果：1）与阴性对照组比较，前列通片高剂量组淋巴细胞转化能力显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。2）与模型对照组比较，阳性对照组及前列通片高剂量组NK细胞活性显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：在本实验条件下，前列通片能够提高机体淋巴细胞转化能力以及NK细胞的活性，具有一定的免疫促进作用。

关键词前列通片；免疫调节；淋巴细胞转化能力；NK细胞的活性

Abstract Objective： To study the effect of Qianlietong Tablets in regulating immune function on mice. Methods： 1） Splenic Lymphocyte transformation test： A total of 60 SPF grade BALB/c mice were randomly divided into negative control group， positive control group， and Qianlietong Tablets low-， medium-， and high-dose groups. After Intragastric administration of different medications for different groups for 30 days continuously， spleens of each group were obtained in aseptic condition. Then spleen lymphocytes were extracted for transformation test. 2） NK cell activity effect test： A total of 60 SPF grade BALB/c mice were randomly divided into negative control group， model group， positive control group and Qianlietong Tablets low-， medium-， and high-dose groups. Except the negative group， mice model with low immune function was built in other groups by intraperitoneal injection of cyclophosphamide， and the mice models were given medicines as well. After 30 days of medication， spleens were obtained in aseptic condition. Spleen lymphocytes were extracted for testing influence on NK cell activity. Results： 1） Compared with the negative control group， the spleen lymphocytes transformation ability of the Qianlietong Tablets high-dose group increased obviously with significant difference（P<0.05）. 2） Compared with the model group， the NK cell activity of the positive control group and the Qianlietong Tablets high-dose group increased obviously with statistical difference （P<0.05）. Conclusion： Under the experimental condition， Qianlietong Tablets can improve lymphocytes transformation ability and NK cell activity， which proves that Qianlietong Tablets has the effect of promoting immune function.

Key Words Qianlietong Tablets； Immune Regulation； Lymphocyte Transformation； NK cell activity

中圖分类号：R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.047

随着中药研究的拓展，中药在机体免疫系统调节方面的作用越来越受到重视。目前已有研究证实中药具有免疫促进和免疫抑制的双向免疫调节作用[1]。罗夏等研究表明复方中药能够提高实验小鼠淋巴细胞转化率，增加巨噬细胞的免疫反应，提高机体免疫力[2]。施军等[3]的研究证实甘草提取物甘草甜素可明显抑制二硝基氟苯诱发的小鼠接触性超敏反应。

前列通片主要由广东王不留行、黄芪、车前子、关黄柏、两头尖、蒲公英、泽兰、琥珀、八角茴香油、肉桂油等组成，具有清利湿浊，化瘀散结的功能，现代药理研究表明，其具有抑制前列腺增生、消炎镇痛、活血祛瘀的作用[4-5]，臨床上主要用于治疗前列腺炎及前列腺增生。现代医学认为，慢性前列腺炎的发病与患者自身免疫能力有一定联系，患者发病后会伴有免疫功能的改变，而局部免疫功能异常正是导致患者病情反复的主要原因[6]。本研究通过小鼠脾淋巴细胞转化试验及NK细胞活性试验，初步探讨前列通片的免疫调节活性，为前列通片免疫调节活性的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 1）SPF级BALB/c小鼠，132只，雄性；体重范围：18.7～22.9 g；由广东省医学实验动物中心提供。2）动物饲养条件：群养，3只/箱，饲养温度与湿度：20.6～22.8 ℃，44.9%～69.8%，采用10 h：14 h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。试验期间动物均按實验要求喂以相应颗粒饲料，所有饲料均由广东省医学实验动物中心提供。动物自由进食饮水。

1.1.2 药物 1）转移因子口服液（批号：150506、150901、150902），由南京瑞尔医药有限公司生产。2）前列通片（广州白云山中一药业有限公司生产，批号：V00028）。

1.1.3 试剂与仪器 1）实验用溶媒或乳化剂：0.5% CMC-Na溶液：量取4/5总配制量的纯净水至烧杯中，准确称取适量羧甲基纤维素钠，磁力搅拌器边加热边搅拌下缓慢加入烧杯中，搅拌至完全溶解，4～8 ℃冰箱放置过夜，第2天定容至所需量即可；纯净水。2）主要实验仪器：BS224S电子天平：感量：0.0001 g，赛多利斯科学仪器（北京）科技有限公司；KDC-2046低速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；SW-CJ-2FD型超净工作台：苏州净化有限公司；CKX41倒置显微镜：日本奥林巴斯公司；311型二氧化碳培养箱：Thermo；全波长酶标仪：赛默飞世尔科技公司；LMQ.C全自动灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。3）主要试剂：刀豆蛋白A（ConA），批号：SLBK7858V，Sigma公司；MTT，批号：M7905，MP Biomedicals，LLC；浓盐酸：批号：20141005-1，广州化学试剂厂；异丙醇，批号：150812，广州市中南化学试剂有限公司；Triton X-100，批号：MR29539，MP Biomedicals，LLC；PBS，批号：10B16B30，博士德生物工程有限公司；Tris base，批号：20121223，MBCHEM；乳酸锂，批号：P1076996，Adamas Reagent Co.，Ltd；

1.2 方法

1.2.1 脾淋巴细胞转化实验 SPF级BALB/c小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组、前列通片低、中、高剂量组，12只/组。阳性组按20 mL/kg的剂量灌胃给予转移因子口服液，阴性对照组灌胃给予0.5% CMC-Na溶液，前列通片低、中、高剂量组按1.02 g/kg、2.04 g/kg、4.08 g/kg的剂量灌胃给予前列通片，1次/d，连续30 d。末次给药24 h后，各组动物无菌取脾，配制脾淋巴细胞悬液。将每份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加50 μL ConA液，另一孔加入50 μL培养液作对照。置5%CO2，37 ℃的细胞培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入5 mg/mL MTT 50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装至96孔板中，每孔作3个平行孔，酶标仪570 nm测定吸光度，然后计算淋巴细胞增殖能力，淋巴细胞增殖能力=Con A孔吸光度值-无Con A孔吸光度值。

1.2.2 NK细胞活性影响试验 SPF级BALB/c小鼠随机分为阴性对照组、模型组、阳性对照组、前列通片低、中、高剂量组，12只/组。除阴性对照组外，其余各组按60 mg/kg腹腔注射环磷酰胺，连续3 d，之后，在第15天、第26天分别按40、50 mg/kg腹腔注射环磷酰胺建立免疫功能低下的小鼠模型。造模同时给药，各给药组给药剂量及方法与脾淋巴细胞转化实验相同，阴性对照组及模型组灌胃给予0.5%CMC-Na溶液，1次/d，连续30 d。末次给药24 h后，各组动物无菌取脾，配制脾淋巴细胞悬液。取靶细胞和效应细胞各100 μL（效靶比50：1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL；靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各100 μL；上述各项均设3个平行孔，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养4 h，然后将96孔培养板以1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，反应6 min，每孔加入1 mol/L的HCL 30 μL，在酶标仪490 nm处测定光密度值（OD），并计算NK细胞活性。

NK细胞活性（%）=反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100%。

1.3 统计学方法所有数据采用（±s）表示，应用SPSS 21.0软件进行统计分析；计量资料数据方差齐，或数据经转换后方差齐，则采用单因素方差分析；若数据经转换后方差仍不齐，采用秩和检验进行统计分析。

2 结果

2.1 脾淋巴细胞转化实验与阴性对照组比较，前列通片高剂量组淋巴细胞转化能力显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 NK细胞活性影响试验与阴性对照组比较，模型组NK细胞活性显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及前列通片高剂量组NK细胞活性显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程中的一个重要阶段，淋巴细胞受到抗原或促有丝分裂原刺激时增殖能力的强弱反映了淋巴细胞功能的高低，淋巴细胞转化试验是细胞免疫功能评价的常用体外试验方法。NK细胞主要存在于外周血和脾中，不依赖抗体也不需要抗原刺激和致敏就能杀伤靶细胞，NK细胞的活性可反映机体细胞免疫应答功能的强弱[7]。因此本研究通过脾淋巴细胞转化实验及对NK细胞活性的影响来评价前列通片对正常小鼠免疫功能的影響。

中医学认为疾病的发生、发展和转归主要与正虚邪盛有关，正虚则抵抗力差，这与免疫低下密切相关，中医采用扶正祛邪治疗法则，取得良好疗效，发现不少补益类和清热解毒类中药具有免疫促进作用[8]。前列通片主要由广东王不留行、黄芪、车前子、关黄柏、两头尖、蒲公英、泽兰、琥珀、八角茴香油、肉桂油等组成。其中，广东王不留行为桑科榕属植物薜荔Ficus pumila L.的干燥花序托，主要含有三萜、黄酮、倍半萜等化合物，现代药理研究表明其具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、增强免疫等作用[9]；黄芪为最常用的“扶正固本，补中益气”中药之一，其主要成分包括多糖、黄酮、苷类等化合物，其中，黄芪多糖与黄芪总苷具有显著的免疫调节作用[10]；车前子主要有多糖、苯乙醇苷等化学成分，现代药理研究表明其在免疫调节方面有一定的活性[11]；此外，蒲公英多糖、八角茴香油提取液等均具有免疫功能促进作用[12-13]。以上，为前列通片促进免疫功能的发挥奠定了一定的基础。本试验研究证实前列通片能够提高机体淋巴细胞转化能力以及NK细胞的活性，具有一定的促进免疫功能的作用，但关于其发挥免疫促进功能的主要成分有待进一步探讨。

参考文献

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