单菌株与复合菌对有机物料腐熟性能的影响

何宗均 梁海恬 李峰

摘要[目的]研究单菌株和复合菌的腐熟性能。[方法]测定了单菌株和复合菌的拮抗效果、除臭能力、纤维素酶和蛋白酶活性，以及复合菌对有机物料的除臭和腐熟效果。[结果]由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS这5种菌株组成的复合菌具有较强的纤维素、蛋白质分解能力及除臭能力，综合性能高于任何单一菌株。复合菌作为腐熟剂进行应用后，从菌数、速效养分、C/N、气味和发酵周期效果来看，对有机物料的腐熟和除臭都起到了显著的促进作用。[结论]复合菌在促进有机物料腐熟及除臭方面效果优于单菌株。

关键词复合菌；有机物料；腐熟

中图分类号S144文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0045-02

Abstract[Objective]To study the maturity performance of single strain and compound bacteria. [Method]The antagonistic effect， deodorization ability， cellulose and protease activity of single strain and compound bacteria， and deodorization and effect of decomposition of compound bacteria on organic materials were determined. [Result] The test result showed that compound bacterium maked up by TARE1013KC， TARE1003DY， TARE2012SR， TARE2009MQ and TARE2008LS had strong comprehensive ability of cellulose， protein decomposition and deodorization ability than any single strain. After compound bacterium as rotten agent was applied in composting， it has played a significant role in promoting the effect of the rotten and deodorization on organic material by indicators of bacterial count， available nutrients， C/N ratio， smell and fermentation cycle.[Conclusion] The compound bacteria in promoting the decomposition of organic materials and deodorization effect was better than that of single strain.

Key wordsCompound bacterium；Organic material；Rotten

基金項目天津市农业科技成果与推广项目（201202090）。

作者简介何宗均（1976—），男，江西宁都人，副研究员，从事农业微生物与废弃物资源化处理技术研究。

收稿日期2016-12-23

我国是世界上农业废弃物产出量最大的国家，每年产生的农业废弃物约40.0亿t，其中畜禽粪便 26.0亿 t，农作物秸秆7.0亿 t，蔬菜废弃物1.0亿～1.5亿 t[1]。随着我国经济的发展，菇渣、中药渣、园林剪切物废弃物的产生量也迅猛增加，这些废弃物由于大部分得不到很好的处理和应用，已对水体、大气、土壤、人体健康及生态系统造成了严重危害。应用有机物料腐熟菌剂快速分解处理有机废弃物生产有机肥料，是国内外解决以上问题的主要措施，这项技术在国内外已经得到了广泛应用。近年来，我国在这方面已进行了大量研究[2-21]。笔者研究了单菌株与复合菌的纤维素酶活性、蛋白酶活性和除臭性能，旨在为有机物料腐熟菌剂的推广应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

细菌菌株TARE1013KC、TARE1003DY，真菌菌株TARE2012SR、TARE2009MQ、TARE2008LS。

营养肉汁琼脂：由蛋白胨5 g、氯化钠5 g、牛肉膏3 g和蒸馏水1.0 L组成，pH 7.0。

马铃薯、葡萄糖琼脂培养基（PDA）：取去皮的马铃薯200 g，切成小块，加水1.0 L煮沸30 min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0 L，加葡萄糖20 g，溶化后分装，灭菌30 min，pH自然。

1.2试验方法

1.2.1菌株的培养。

TARE1013KC和TARE1003DY培养基均为液体营养肉汁培养基，经121 ℃实罐灭菌30 min后，28～30 ℃培养36～48 h。

TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS采用马铃薯、葡萄糖培养基，把液体培养基分装于0.5 L三角瓶中，经灭菌后接入各真菌斜面菌种，于180 r/min 28～30 ℃培养48 h，当摇瓶内出现菌丝密度大，菌丝球明显不浑浊即可。

1.2.2菌株间的相互拮抗试验。

采用钢圈法进行抑菌试验。取其中1种菌（A）的发酵液0.10 mL涂于平板上，然后在每个平板的固体培养基上摆放2个已灭菌的钢圈，再在每个钢圈中加入0.25 mL的A菌之外的任何1种菌（B）的发酵液，每个处理重复3次，以只接A菌的平皿为对照（CK）。28 ℃培养并定期观察抑菌情况。

1.2.3

除臭能力的测定。

采用氨气检测、硫化氢检测和感官检测对微生物菌剂的除臭能力进行评价。将活化后的TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS分别用液体培养基培养，得到各个菌株的菌液。将各个菌株的菌液和复合菌剂分别进行如下试验：将菌液接在发酵除臭基质内，于500 mL烧杯中混匀（每份发酵除臭基质接种10 mL菌液），作为试验样本，设置发酵除臭基质作为对照样本，各样本用牛皮纸及1层塑料纸封口。每个样本（6种试验样本和1种对照样本）设置3个平行处理，每个平行处理设置3次重复。在第1个平行中放置内盛20 mL 2%硼酸溶液的小烧杯，用以吸收发酵过程中产生的氨气，第7天用酸滴定法测定；在第2个平行中放置内盛20 mL 0.05 kg/L乙酸锌溶液，用以吸收发酵过程中产生的硫化氢，第7天用碘量法测定；第3个平行，第7天进行感官测定。

1.2.4蛋白酶和纤维素酶活性的测定。

蛋白酶活性测定方法参照中华人民共和国轻工行业标准QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》中附录A3蛋白酶的测定方法。

纤维素酶活性的测定方法：称取样品用蒸馏水稀释10倍，充分振荡，静置30 min，过滤，其滤液即为原样酶液。取3支带有20 mL刻度的试管，1支作为空白对照，其余2支作为平行样品管。样品管中加1 mL原样酶液，然后3支试管中分别加入4 mL已预热至60 ℃的底物溶液，在60 ℃水浴锅中反应20 min取出，每管立即加入1 mL 2.0 mol/L氢氧化钠溶液和2 mL DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1 mL原样酶液。将3支试管放入沸水浴中，显色5 min后立即取出，流水冷却，定容至20 mL，用分光光度计于490 nm处测定OD值。

根据标准曲线换算成葡萄糖量

式中，U为样品的酶活力（μg/min）；M0为对照葡萄糖量（μg）；

M1为分解后样品质量（μg）；20为酶与底物反应时间（min）。

1 mL原样酶液1 min产生1 μg葡萄糖定义为1个酶活力单位（U）。

1.2.5复合菌在有机物料的除臭和腐熟上的应用试验。

堆肥原料：鸡粪、牛粪、玉米秸秆、可堆腐生活垃圾和蘑菇渣，质量比为5〖DK〗∶5∶3∶2∶2。设2个处理，即加复合菌处理和未加菌剂的空白对照（CK），每个处理2 t原料，3次重复，垛型堆制发酵。发酵周期以发酵温度降至室温为止计算所得，发酵第15天对2个处理进行取样分析，包括速效氮、速效磷、速效钾总量、C/N、菌数和大肠杆菌，并观察发酵的物理状态。

2结果与分析

2.1复合菌

将TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS单菌种质量比为3∶2∶2∶1∶2混合拌匀后制得复合菌，复合菌有效活菌数达2×108 个/g。

2.2拮抗试验

由表1可知，TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS 5种菌之间无抑制作用，拮抗反应均为阴性。

2.3除臭能力

结合感官、氨气和硫化氢含量的检测结果可知，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS组成的复合菌与TARE1013KC单个菌株的除臭效果不存在显著差异，但显著好于TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ、TARE2008LS和CK（表2）。

2.4纤维素酶和蛋白酶活性

由表3可知，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS菌株组成的复合菌具有很强的纤维素和蛋白质分解能力，综合性能高于任何单一菌株，也高于有机物料腐熟剂国家标准规定的纤维素酶活性（30.00 U/mL）和蛋白酶活性（15.00 U/mL）的要求，复合菌可以作为有机物料腐熟剂进行使用。

2.5复合菌对有机物料的除臭能力和腐熟效果

由表4可知，从各项指标来看，复合菌的发酵效果好于CK，其中复合菌的发酵温度在2 d内能够达55 ℃，CK需要4 d；发酵的结果表现为复合菌微生物数量生长繁殖活跃，菌数和速效N、P、K含量均高于CK，发酵周期也大大缩短，其中复合菌为15 d，CK 32 d，复合菌发酵颜色黑褐色，无臭味，而CK为浅色，有臭味。发酵15 d后复合菌和CK的C/N分别为153、22.3，C/N愈低，表示微生物对堆肥有机物料中纤维素降解作用越好。从菌数、速效养分、C/N、气味和发酵周期效果来看，加入复合菌对有机物料的腐熟和除臭都有促进作用。

3结论与讨论

（1）该研究表明，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS菌株组成的复合菌具有较强的纤维素、蛋白质分解能力及除臭能力，综合性能高于任何单一菌株，作为有机物料腐熟剂进行应用后，从菌数、速效养分、C/N、气味和发酵周期效果来看，对有机物料的腐熟和除臭都起到了显著的促进作用。柳玲玲等[2]对不同腐熟菌剂对鸡粪堆肥效果的影响研究表明，鸡粪堆肥通过接种微生物菌剂，可以明显提高堆肥初期的发酵温度，加快堆肥物料的水分挥发，缩短堆肥发酵周期，促进堆肥快速腐熟。赵晓锋等[8]分离筛选出细菌KB217、放线菌KA46和真菌KF21这3个菌株，使鸡粪堆肥的氨气释放量分别降低了59.40%、55.05%和56.38%。3种菌株之间无拮抗作用，三者混合制剂能使氨气释放量降低67.33%，且縮短氨气释放时间，这与该研究结果相似。

（2）微生物菌株是一種容易变异的生物，生长繁殖受环境影响也非常大，因此，微生物腐熟剂或除臭剂的特性易变异，性能不稳定，对有机物料的腐熟和除臭效果也会造成不同程度的影响，今后应该在这方面加大研究力度。

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