不同钙浓度对两种岩溶植物幼苗生长及其酶活性的影响

张芳 宋敏 彭晚霞 曾馥平 杜虎 胡芳 陈莉 苏樑

摘要： 該研究采用砂培法，以狗骨木（Swida wilsoniana）和南酸枣（Choerospondias axillaris）两种岩溶植物为研究对象， 用不同钙离子（Ca2+）浓度（设为 5、35、70、150、300 mmol·L1的5个水平）的营养液进行培养，研究其对两种植物的生长及酶活性的影响。结果表明：狗骨木和南酸枣的株高在5 mmol·L1时最大，之后随Ca2+浓度上升呈下降趋势，南酸枣在300 mmol·L1时有所回升。两种植物的根、枝、叶生物量和总生物量随着Ca2+浓度增加而减少。狗骨木叶、枝、根的生物量分配比率为根>枝>叶，南酸枣在35 mmol·L1时表现为根>枝>叶，其他在Ca2+浓度下均为枝>根>叶，叶生物量分配少。狗骨木和南酸枣的丙二醛（MDA）含量在150 mmol·L1时最低，且狗骨木的低于南酸枣。钙胁迫下，与南酸枣相比，狗骨木维持较高的过氧化氢酶 （CAT）活性和可溶性糖含量。两种植物在5和150 mmol·L1的Ca2+浓度下各项指标处于较适水平，而在300 mmol·L1的高钙离子浓度下受到明显的胁迫， 对比两种植物，狗骨木较南酸枣在高钙浓度下有更好的适应性。

关键词： 幼苗， 生物量， 还原糖， 岩溶植物， 抗氧化酶

中图分类号： Q945

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）06070709

Abstract： Calcium （Ca） is an essential nutrient for plant growth； however， high Ca concentrations have detrimental effects on several plant species， while a few plant species have adapted to high levels of Ca via multiple mechanisms. The limestone soils of karst regions in southwest China are characterized by high levels of Ca， which have substantial influences on plant physiological characteristics and distribution. High Ca concentrations influence photosynthesis and might even destroy organelles resulting in death of the plant. Adaptation mechanisms of plants to high concentrations of Ca are very complex processes and are relative to all aspects of plant growth. Selection of suitable tree species plays a key role in ecological restoration. In order to investigate the physiological adaptation mechanisms of plants to high calcium conditions in the karst region of Southwest China， a pot experiment was conducted with seedlings of two species， i.e.， Swida wilsoniana and Choerospondias axillaris. To exclude the influences from other confounding factors， each pot was filled with sand instead of soil. The seedlings were treated with five Ca levels， i.e.， 5， 35， 70， 150， 300 mmol·L1. The growth and enzyme activities of the two plant species were measured. The results showed that the both species were the highest at 5 mmol·L1， and tended to decrease with the increase in Ca concentration. The biomass of roots， branches， leaf and total biomass of both species demonstrated a downward trend as Ca concentration increase， but those of C. axillaris showed a tendency to increase for the 300 mmol·L1 treatment. The biomass allocation ratio was in the order of root > branch > leaf for Swida wilsoniana， and root > branch > leaf for S. wilsoniana at 35 mmol·L1. The biomass allocation at other Ca levels showed a variation pattern of branch > root > leaf for both species. MDA content was the greatest at 150 mmol·L1 for both species. MDA content of Choeropondias axillaris was lower than that of Swida wilsoniana. The soluble sugar content and CAT activity of S. wilsoniana under calcium stress were higher than those of Choerospondis axillaris. The physiological indices reached optimum levels at the Ca concentrations of 5 and 150 mmol·L1 for both species， while were inhibited at the concentration 300 mmol·L1， which led to a decline of photosynthetic capacity. Our results also revealed that S. wilsoniana had better adaptability to high Ca concentrations relative to C. axillaris.

Key words： seedling， biomass， solube sugar， karst plant， antioxidative enzyme

钙作为生物膜的稳定剂及偶联胞外信号与胞内生理生化反应的第二信使，具有维护植物细胞壁和细胞膜结构与功能的作用（Bush，2003），与CaM结合调节细胞内多种重要酶的活性和生理过程。钙是植物生长中必需的元素之一，植物体内钙的含量为0.1%～0.5%，植物体在适合的钙浓度下才能保持正常发育（White et al，2003）。细胞中过高的游离钙会对植物的生长产生不利的影响，与PO43–产生沉淀，从而使磷代谢的相关过程受到干扰，使钙信号传递受阻，导致植物的生长受到影响（Hirschi 2004）。喀斯特独特的地质积累和气候条件决定了其适生植物具有嗜钙性、耐旱性和石生性特点（彭晚霞等，2008；宋同清等，2014），喀斯特钙含量约为1.8%，非喀斯特地区如南方红黄壤钙含量为0.5%，钙含量为非喀斯特的三倍，高钙胁迫会损害植物细胞，导致植物死亡，这也是喀斯特地区许多植物无法正常生长的原因。

南酸枣（Choerospondias axillaris）为落叶乔木，性喜阳光，喜温暖湿润气候，适生于深厚肥沃而排水良好的酸性或中性土壤，为造林绿化先锋树种。狗骨木（Swida wilsoniana）为常绿乔木，喜光、喜钙、耐旱、根系扩展，萌芽力强，石灰岩山地的优良速生树种，两者均为喀斯特高钙环境的适生植物。在正常条件下，生物体内自由基的产生和消除之间处于平衡状态，当处于逆境条件时，细胞内自由基产生和消除的平衡遭到破坏，而出现活性氧的积累（杨春祥等，2005）。过多的活性氧会损害破坏膜、蛋白质和核酸（Ma et al，2013）。但是，植物体内也存在活性氧消除系统，这些酶的相互协调作用，维持活性氧和自由基产生和清除平衡，使植物进行正常的生长和代谢。研究表明镉（韩航等，2016）、低氧（刘义玲等，2010）、低温胁迫（吕星光等，2016）使细胞质膜氧化加剧，根系受到伤害，植物生长受到抑制。干旱胁迫（井大炜等，2013）和盐胁迫（张栎等，2014）导致活性氧大量增加，超出抗氧化酶的清除能力，植物生长受到抑制。目前高钙胁迫对植物生长及酶活性的影响研究较少且不全面。

本研究针对西南喀斯特地区土壤高钙环境，选择狗骨木和南酸枣两种岩溶适生植物幼苗为研究对象，采用砂培培养并人为控制钙供应，经过长期培养后，测定两种植物株高和生物量、丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和可溶性糖的含量，分析不同钙离子浓度下两种植物各指标变化特征，探讨植物对喀斯特地区高钙环境的适应方式，揭示西南喀斯特地区植物对高钙环境的生理生态适应机制，为群落生态学发展、喀斯特地区植被迅速恢复和生态重建提供理论支持。

1材料与方法

1.1 研究区概况

试验地设在中国科学院环江喀斯特生态系统观测研究站内，属亚热带性季风气候。年均气温16～20 ℃，最冷月份为1月，平均温度10.1 ℃，极端最低温度-5.2 ℃，最热月份是7月，平均温度28 ℃，极端最高溫度38 ℃。平均降水量1 389 mm，降雨集中在4-9月份，约占全年降水量70%。年均蒸发量为1 571 mm，空气年均相对湿度为70%，年均日照为1 451 h，年均太阳总辐射为334～413 KJ·cm2。该区域为典型岩溶峰丛洼地景观，地势四周高、中间低，最高海拔647 m，最低海拔272 m，≥25°的坡面占62%。研究区中以藤本、草本、灌木和蕨类植物居多，小乔木一般为喜钙和耐旱树种。

1.2 试验培养及处理

采用砂培法来排除各因素对实验结果的影响，通过配得不同Ca2+浓度营养液对植物进行培养。实验为单因素5水平3重复完全随机设计。选取狗骨木和南酸枣两个喜钙树种，均为一年生植物、长势基本一致。营养液的Ca2+浓度分别设为 5、35、70、150、300 mmol·L1的5个水平，其中用5 mmol·L1的Ca2+浓度模拟酸性土中交换态钙含量，150 mmol·L1模拟石灰土中交换态钙平均含量，每个水平设3个桶，每桶栽植4株树苗（罗绪强等，2013）。共60个桶。

石英砂处理：先将石英砂用水浸泡，再经0.5%盐酸浸泡24 h，之后用自来水洗至中性。再将石英砂装入各个塑料桶（直径60 cm，高50 cm）中，上沿空出3～5 cm，以便水和营养液的浇灌。

营养液的配制：采用霍格兰氏（Hoaglands）、阿农（Arnon）营养液为基础营养液。用乙酸钙Ca（CH3COO）2配出不同Ca2+浓度梯度的各级营养液。

植物的移栽：选择阴天进行植物的移栽，移栽前将植物根系洗净，尽量减少对植物根系的损害。

4月开始培养，培养时间为2个月。每隔2 d浇1次营养液，每次每桶浇400 mL，各处理营养液施入量、施入时间均一致。每2 d每桶浇去离子水约400 mL。在桶底侧开一个小口接上塑料软管，下设接漏桶，多余营养液从盆底的水龙头流出、收集并在浇完营养液第二天返桶。根据水分及植物生长状况适当调整。培养期间每7 d测定1次树高。至6月初开始取样测定，并在测定过程中继续培养。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 株高和生物量测定 11月份进行取样，每个处理选取3株长势均一的植株整体采样。测定其株高。之后分离其根、茎、叶，分别取样称得鲜重，然后在75 ℃下烘干至恒重称重，计算生物量。

1.3.2 过氧化氢酶（CAT）的测定取待测叶片0.25 g放入预先冷却的研钵中，加2 mL预先冷却的磷酸缓冲液，在冷浴下研磨成匀浆，之后加磷酸缓冲液来冲洗研钵，定容25 mL，并在4 ℃、10 000 r·min1下离心20 min，取上清液即为CAT粗酶液。以煮死酶液为空白，25 ℃预热后加入0.3 mL 0.1 mol·L1的H2O2， 240 nm下计时比色，以1 min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）（王韶唐，1986）。

过氧化氢酶活性（u·g1·min1）=ΔA240×VT0.1×V1×t×FW

式中，ΔA240为AS0-（AS1+AS2）/2， AS0为加入煮死酶液的对照管的吸光度，AS1、AS2为样品管吸光度，VT为粗酶提取液总体积（mL），V1为测定用粗酶液体积（mL），FW为样品鲜重（g），0.1为A240每下降0.1为1个酶活单位（u），t为加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

1.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）的测定取待测叶片0.25 g放入预冷后的研钵中，加入2 mL预冷后的磷酸缓冲液，在冷浴下研磨成匀浆，之后加磷酸缓冲液冲洗研钵，定容到10 mL，并在4 ℃、10 000 r·min1下离心20 min，取上清液为SOD的粗酶液。

显色反应：选取透明度好、材质相同的试管4支，2支为测定，2支为对照，3 mL反应液中含50 mmol·L1磷酸缓冲液（pH7.0），13 mmol·L1蛋氨酸，75 μmol·L1氮蓝四唑（NBT），0.l mmol·L1乙二胺四乙酸（EDTA）和0.l mL酶液，最后加4 μmol·L1核黄素。放置在4 klx日光灯之下进行反应，温度为25 ℃，反应10 min放置在黑暗终止其反应，用遮光的对照试管作空白，在560 nm波长之下测得各管的吸光度（王韶唐，1986）。

1.3.4 丙二醛（MDA）的测定称取剪碎的新鲜材料0.5 g，加入10%的TCA 2 mL和石英砂，之后研磨成匀浆，然后加TCA 3 mL继续研磨，匀浆离心，4 000 r·min1 30 min，取上清液作为样品提取液。吸取离心之后的上清液2 mL（而对照则加2 mL蒸馏水），加2 mL 0.6%的TBA溶液，混匀物放在沸水浴反应15 min，之后迅速冷却再离心。取上清液在532、450 和600 nm波长之下的消光度（王韶唐，1986）。

计算公式：

MDA（μmol·g1）=MDA浓度×提取液体积植物组织鲜重

1.3.5 可溶性糖测定叶片中的可溶性糖提取：剪碎混匀后称取新鲜样品0.5～1.0 g（或干样粉末5～100 mg），然后放入试管后，加15 mL蒸馏水，沸水浴加热煮沸20 min后，取出冷却，然后过滤转入100 mL容量瓶，蒸馏水冲洗数次后，定容。标准曲线的制作：先取6支试管，按0～5编好号，之后按表1的要求加入各试剂。

先将各试管混匀后，先在沸水浴中放置10 min，再取出冷却，然后在620 nm的波长之下，使用空白调零后测定光密度，将光密度作为纵坐标，所测得葡萄糖含量（μg）作为横坐标完成标准曲线。

样品测定：吸取已提取样品1.0 mL后加5 mL蒽酮试剂，然后测定光密度，每个样品3次重复。

可溶性糖含量（μg·g1）=从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（mL）×稀释倍数/[测定用样品液的体积（mL）×样品重量（g）×106]×100

1.4 数据分析

数据用Excel 2003进行数据处理和计算，用SPSS 19.0进行多重比较、方差分析和相关分析，用Origin 9.1制作图表，用Pearson相关系数法计算变量之间的相关性。

2结果与分析

2.1 不同钙离子浓度对两种植物株高的影响

由图1可知，狗骨木和南酸枣的株高均在钙离子浓度为5 mmol·L1时最大，之后随着钙离子浓度增加而减小，南酸枣的株高在5 mmol·L1为151.6 cm，显著高于其他浓度处理，在150 mmol·L1时最低，为101.1 cm，两者相差49.95%。狗骨木的株高在5 mmol·L1为113.2 cm，在300 mmol·L1时最低，为72.7 cm，两者相差55.71%；前4个水平株高差异不显著，但均显著高于300 mmol·L1。从表2看出，狗骨木株高与钙离子浓度为显著负相关，南酸枣无显著相关。

2.2 不同钙离子浓度对两种植物生物量的影响

由图2可知，狗骨木的叶、枝生物量均随钙离子浓度的上升而下降，根的生物量大小依次为35>70>

5>150>300 mmol·L1。南酸枣的叶、枝、根的生物量总体上随钙离子浓度的上升呈下降趋势，但是在不同的部位变化不同，叶和枝的生物量除5 mmol·L1时与其他各浓度间的差异显著，其他差异不显著，而根的生物量整体差异不显著。由表2可知，狗

骨木的叶、枝、根的生物量与钙离子浓度均为显著负相关，南酸枣无显著相关。

狗骨木的总生物量随钙离子浓度的上升而下降，在300 mmol·L1时是5 mmol·L1时的33.18%。南酸枣的总生物量变化与狗骨木相似，在300 mmol·L1有所回升，在150 mmol·L1时达到最低值，是5 mmol·L1时的48.69%。对比狗骨木和南酸枣的总生物量可发现，在5和300 mmol·L1时南酸枣的总生物量要大于狗骨木，而在35、70和150 mmol·L1时狗骨木的总生物量大于南酸枣。狗骨木总生物量与钙离子浓度显著负相关，南酸枣无显著相关（表2）。

2.3 不同钙离子浓度对两种植物生物量分配比率的影响

由表3可知，狗骨木的枝叶比、根叶比随钙离子浓度的升高而升高，与钙离子浓度均为显著正相关。狗骨木的根枝比大小为70>35>150>5>300 mmol·L1，中间高两头低，与钙离子浓度无显著相关。由比值可知，狗骨木各部位的生物量为根>枝>叶。而南酸枣的枝叶比、根叶比大小为35>300>150>70>5 值可知，南酸枣根、枝生物量相差不大，但叶生物量积累较少。

2.4 不同钙离子浓度对两种植物丙二醛（MDA）含量的影响

由图3可知，南酸枣的MDA含量随着钙离子浓度的增大表现为先减少后再增加，在5～150 mmol·L1之间MDA含量随钙离子浓度升高而下降，在300 mmol·L1时出现较大的升高，相比150 mmol·L1时升高了113.82%。狗骨木的丙二醛含量随着钙离子浓度的增大表现为先上升后下降再上升的趋势，在5～70 mmol·L1之间MDA含量随钙离子浓度升高而上升，在150 mmol·L1时出现下降，然后300 mmol·L1又有小幅上升。南酸枣的丙二醛含量均大于狗骨木，在70 mmol·L1時二者相差最小，为2.33%，在300 mmol·L1时二者相差最大，为118.72%。由表4可知，狗骨木MDA与钙离子浓度均无显著相关，而南酸枣为显著相关。

2.5 不同钙离子浓度对两种植物超氧化物歧化酶（SOD）含量的影响

由图3可知，狗骨木的SOD在5 mmol·L1时值最高，在70～300 mmol·L1时随着钙离子浓度的升高而下降，最低值在300 mmol·L1，两者相差32.56%。南酸枣的SOD含量与狗骨木变化趋势相似，在35 mmol·L1时降至最低，然后在35～150 mmol·L1时随着钙离子浓度的升高而升高，在150 mmol·L1时达到最高值，最后在300 mmol·L1出现降低，其最高值与最低值之间相差21.49%。在5 mmol·L1时狗骨木的SOD含量要高过南酸枣，之后随钙离子浓度增加南酸枣的SOD含量要高于狗骨木。由表4可知，狗骨木和南酸枣的SOD与钙离子浓度均无显著相关。

2.6 不同钙离子浓度對两种植物过氧化氢酶（CAT）含量的影响

由图3可知，随着钙离子浓度的增大，南酸枣CAT含量变化较小，其最大值和最小值分别为5和35 mmol·L1，两者相差37.5%。狗骨木的CAT含量随着钙离子浓度的增大呈上升趋势，相比5 mmol·L1下的CAT含量，随钙离子浓度的增加，分别增加了50%、60%、70%、79.3%。在5 mmol·L1时南酸枣的过氧化氢酶含量要高过狗骨木，之后随钙离子浓度增加狗骨木的过氧化氢酶含量要高于南酸枣。由表4可知，狗骨木CAT与钙离子浓度为显著正相关而南酸枣无显著相关。

2.7 不同钙离子浓度对两种植物可溶性糖含量的影响

由图3可知，狗骨木和南酸枣的可溶性糖含量随钙离子浓度的升高均出现波动的变化，狗骨木可溶性糖含量在不同的钙离子处理下表现为5>70>300>35>150 mmol·L1，南酸枣的可溶性糖含量在不同的钙离子处理下表现为5>150>300>35>70 mmol·L1。对比两种可溶性糖的含量，可以发现在5 mmol·L1时南酸枣的可溶性糖含量要高过狗骨木，之后随钙离子浓度增加狗骨木的可溶性糖含量要高于南酸枣。由表4可知，狗骨木和南酸枣的可溶性糖与钙离子浓度无显著相关。

3讨论与结论

高钙对植物产生的胁迫直观表现为植物株高和生物量的降低。生物量是植物积累能量的主要体现，其在各器官中的分配方式受外界环境的影响（Karel et al，2006；Schmid et al，2002）。本研究中随着钙离子浓度的升高，植物的生长受到了胁迫，株高和生物量出现不同程度的降低，两种植物在高钙环境下减少株高和生物量采取保守策略进行缓慢的资源获取和消耗（王振兴等，2012），这与Zhu et al（2015）研究结果一致。狗骨木和南酸枣的适应方式不同，狗骨木通过加强钙的吸收及转运维持植物体较高的钙含量水平（姬飞腾，2009），南酸枣通过减少钙的吸收量维持较低的钙水平及其向地上部分转移（姬飞腾，2009）。植物通过调节地下与地上之间的生物量分配，来适应不同环境（杨昊天，2013），从生物量分配比率可知，狗骨木的生物量分配为根>枝>叶，植物将生物量分配到根中，吸收更多的钙来适应高钙环境。南酸枣叶、枝、根的生物量含量大小除35 mmol·L1时为根>枝>叶，其他钙离子浓度下均为枝>根>叶，南酸枣根、枝生物量相差不大，叶生物量分配少，可能是通过叶片凋落将钙离子排除体外以维持体内较低钙浓度（黄雍容，2014）。MDA含量是膜脂过氧化的一个指标，反映了逆境条件下的损伤程度（Weng et al，2015）。它的积累会对生物机体细胞产生毒害作用，使膜结构和功能受到破坏（Javadian et al，2010）。在0～150 mmol·L1之间，随着钙离子浓度增加，狗骨木出现先升高后较低的趋势，而南酸枣含量逐渐降低，均在150 mmol·L1时MDA含量最低，过高或过低含量的钙均对MDA含量造成影响。在300 mmol·L1时MDA迅速增加，这说明植物受到迫害，清除能力降低，其膜系统受到较严重的氧化破坏（龙明华等，2005），这与前人研究MDA变化一致（Benhamdi et al，2014；Zhou et al，2015）。南酸枣的MDA含量大于狗骨木，说明狗骨木所受胁迫小，有较高的耐钙能力，更有利于在高钙环境中生存。

SOD和 CAT在植物体内协同作用，在逆境胁迫中清除过量的活性氧，保护膜结构，使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵御逆境胁迫伤害（Liang et al，2003）。本研究中狗骨木和南酸枣的SOD变化相似，均为先降低后增加再降低，两种植物分别在5、150 mmol·L1达最大值。在300 mmol·L1植物的SOD含量出现下降，可能是钙离子的浓度太高，对狗骨木和南酸枣两种植物体产生了毒害作用，活性氧无法及时清除，这表明过高的钙浓度已超出了狗骨木和南酸枣的耐受范围。这与陈涛等（2011）和易心钰等（2016）的研究结果相似。植物在受到胁迫或病害时，先产生H2O2 和其它活性氧，CAT能分解H2O2，从而清除过氧化体中的H2O2。本研究中南酸枣的CAT含量变化平稳，而狗骨木的CAT随着钙离子浓度的增加而增加。CAT在5 mmol·L1时最低，随着钙离子浓度增加而增加，有利于及时清除植株体内过氧化物的积累，保证正常的生理代谢进行。南酸枣变化幅度较小，清除植株体内过氧化物的能力弱，表明狗骨木对高钙的适应性比南酸枣强。

作为植物体内调节有机渗透物质之一的可溶性糖，在植物受到胁迫时，植物调节可溶性糖等物质的增高来降低细胞渗透势，从而缓解胁迫对植物的损害。通过对植物可溶性糖含量的测定得知植物对胁迫环境的适应能力（吉增宝等，2009）。狗骨木的可溶性糖含量随着钙离子浓度的上升出现上下波动，变幅较小，而南酸枣的可溶性糖含量在70 mmol·L1时出现大幅下降。细胞质钙浓度过高会导致植物死亡，狗骨木保持高可溶性糖含量，稳定膜的透性，将高浓度钙阻隔在细胞质外，维持活性。

两种植物在5 mmol·L1模拟普通的酸性土和150 mmol·L1模拟石灰土的钙离子浓度下各项指标处于最适水平，反映出狗骨木和南酸枣在普通的酸性土、石灰土环境中表现出较好的适应性，两种典型岩溶植物在300 mmol·L1的高钙离子浓度下受到了明显的胁迫。胁迫期间，狗骨木和南酸枣株高及生物量减少，以保守的姿态度过胁迫。随着钙离子浓度的升高，狗骨木相对于南酸枣有着较高的CAT、可溶性糖含量，可能是高钙胁迫下通过钙代谢机制，开启 Ca2+通道，Ca2+与 CaM 结合后作为激素和环境信号传导的第二信使能调节酶的活性，可减少膜脂过氧化，稳定膜的透性，更有利于在高钙环境中生存。本研究选取的两种喀斯特典型岩溶植物，均为喀斯特高钙环境的适生植物，两者在钙胁迫下的变化有一定的相似性，可在以后的研究中加入嫌钙植物作为对比。

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