光甘草定对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

赵伟　宋歌

摘要：单增李斯特菌属于典型的革兰氏阳性致病菌，是一种严重的人畜共患食源性致病菌。由于生物被膜的形成使得对单增李斯特菌的防治变得更加困难。本试验首先将单增李斯特菌加入到96孔细胞培养板恒温培养48 h进行生物被膜培养，然后分别加入终浓度为10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的光甘草定孵育后，于6 h后提取单增李斯特菌eDNA并测定其含量变化情况。同时利用结晶紫染色法观察不同浓度的光甘草定作用2 h、4 h、6 h和8 h后单增李斯特菌生物被膜形成的影响情况。结果显示光甘草定对单增李斯特菌eDNA和生物被膜形成均有一定的抑制作用。本实验通过观察光甘草定浓度下单增李斯特菌生物被膜的形成情况，为甘草抗菌能力的进一步研究和临床应用以及单增李斯特菌的防治提供一定的理论依据。

关键词：单增李斯特菌；生物被膜；光甘草定

中图分类号：S 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）06-0004-03

单增李斯特菌是一种人畜共患食源性病原菌，它主要以食物为传染媒介，广泛存在于自然界及各种食品中，且在4°C环境中仍可生长繁殖，可引起人、畜感染发病，死亡率高。食用了被单增李斯特菌污染的食物后可以引起李斯特菌病，李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染。近年来，李斯特菌病在世界范围内都有发生，且发病具上升趋势，引起国内外广泛重视。因此，单核细胞增生性李斯特菌不仅对畜牧业的发展具有重要影响，而且对人们的健康带来危害。

1 李斯特菌生物被膜

李斯特菌作为1种食源性疾病病原菌，因其分布广泛、致病率致死率较高而恶名远扬外，还因其会在食品、瓜果蔬菜等接触表面吸附聚集分泌生物被膜，而对人类的清除防疫措施带来了很大的麻烦。据研究发现，动态条件下，单增李斯特菌的生物被膜三维球形网链状结构，对理化因子、抗生素、杀菌剂等具有极强的抵抗力[1]。

许多研究证实了李斯特菌可以形成生物被膜，李燕杰等比较研究了银染法、结晶紫染色法、扫描电镜法3种不同方法定性观察李斯特菌生物被膜的效果。研究表明，3种方法均可定性观察李斯特菌生物被膜。在另一项研究中，李燕杰等采用微孔平板和结晶紫染色法观察不同培养条件下单增李斯特菌生物被膜的形成与生长。研究表明，李斯特菌在35°C，中性略偏碱性条件下，TSB培养6～8 h可形成稳定的生物被膜。单增李斯特菌的生物被膜主要分为胞外基质和菌体，而胞外基质又是由胞外DNA胞外蛋白和胞外多糖等组成[2]。单增李斯特菌生物被膜的形成受到胞外DNA胞外多糖、鞭毛糖蛋白、胞外结合蛋白和群感应系统等的影响[3]。鞭毛在生物被膜的形成中起着关键的作用，介导运动使浮游单增李斯特菌的游动、非活性物体表面的附着、单增李斯特菌的个体从载体表面的扩散、与细胞外基质的相互作用。鞭毛蛋白中的5种基因FlaR（鞭毛调节因子）、PrfA（正调控因子）、DegU（降解酶调节因子）、MogR（运动基因调节因子）和GmaR（糖基转移酶和运动抑制子）。

有研究表明，胞外DNA与单增李斯特菌的最初粘附和早期形成有关[4]，主要是与胞外多糖结合后对生物被膜的形成造成影响单增李斯特菌染色后可观察到细胞周围存在致密的胞外多糖，目前对于胞外多糖和胞外结合蛋白对于单增李斯特菌的生物被膜的影响的研究不是很清楚，但是有研究发现，单增李斯特菌胞外蛋白在单增李斯特菌最初聚集到介质表面起重要作用[5] 细菌群中细菌通过信息交流来感觉、整合、处理环境的现象称为群体感应。单增李斯特菌存在两个群体感应体系。为寡肽介导的 Agr群体感应系统和自诱导2（AI-2）LuxS群体感应系统，Agr群体感应系统可直接正调控生物膜的形成，也可通过调控耐药、毒力因子间接调控生物被膜的形成[6]。正因单增李斯特菌的致病率高、危害性大、易产生耐药性、易在物体表面形成生物被膜，而对人类的生产生活带来危害，为人类的对李斯特菌病预防和清理带来危害。

2 研究的目的和意义

由于李斯特菌在自然界中廣泛存在，并可以形成生物被膜，使得李斯特菌对外界环境的抵抗力大大增强，且80%李斯特菌病的发生又是由生物被膜引起的。生物被膜引起的细菌多重耐药性给临床治疗带来了巨大的困难。而光甘草定（Glabridin）是中药甘草的主要成分，是从药用植物甘草根、茎中提取的一种具有高甜度、低热量、安全无毒的有效活性成分，具有抗炎、抗变态反应、抗病毒和免疫调节等作用，在各种疾病的临床治疗上取得确切疗效。本研究通过观察光甘草定在不同浓度下，对单增李斯特菌生物被膜的形成情况，以初步探讨光甘草定对单增李斯特菌生物被膜的抗菌活性，为甘草抗菌能力的进一步研究和临床应用以及李斯特菌病的防控提供理论依据。

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1材料来源

光甘草定为洛阳蓝冰贸易有限公司产品。单增李斯特菌21634购自中国工业微生物菌种保藏中心。

3.1.2主要实验仪器

CO2培养箱（青岛龙杰仪器公司）、96孔细胞培养板、高压灭菌锅（购于上海三申）、温箱（购于上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、冰箱（购于扬子集团）、超净工作台（购于苏州争化设备公司）、电子天平（购于北京赛多利斯天平有限公司）、THZ-92C气浴恒温振荡器 数码鼓风干燥箱（GZX-9070 MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、分光光度计、平皿若干、1.5mL EP管、10 μL枪头若干、200 μL枪头、1 mL枪头、1.5 mL EP管架、细菌培养瓶若干、大小瓶塞若干、酒精灯、电磁炉、剪刀、镊子、接种环、锥形瓶若干、量筒、250 mL试剂瓶若干、100mL试剂瓶若干、一次性手套，医用胶带、脱脂棉、封口薄膜等。

3.2 主要试剂的配制

（1） LB液体培养基：NaCl 1.0 g、蛋白胨 1.0 g和酵母提取物0.5 g充分溶解于蒸馏水100 mL，120°C高压灭菌30 min，4°C冰箱保存备用。

（2）10 mg/mL光甘草定溶液：0.03 g光甘草定充分溶解于3 mL PBS中。

（3）结晶紫溶液：称取0.04 g结晶紫溶解10 mL蒸馏水。

（4）0.5M EDTA：称取186.1g EDTA-Na2·2H2O，置于烧杯中，加入800 mL蒸馏水，用NaOH调pH至8.0，然后用蒸馏水定容到1L，灭菌后室温保存备用。

3.3实验方法

3.3.1 细菌复苏

把超净工作台的紫外灯打开，将试管、LB液体培养基放入工作台，消毒灭菌20～30 min，然后点燃酒精灯，在酒精灯旁完成实验，消毒灼烧空试管口，消毒培养液瓶口、到入1/3左右。从-80°C冰箱取出单增李斯特菌，接种环灼烧放凉后沾菌，加入试管。用过的接菌环、试管盖上纸盖子封口，用报纸包好，放入THZ-92C气浴恒温震荡器过夜（37°C 12 h），整理超净工作台。

3.3.2 菌液转接与生物被膜培养

将复苏好的细菌从恒温摇床培养箱内取出，观察小试管内的细菌的情况，细菌的形态，色泽，透明度等，在净化操作台中，取锥形瓶加入3 mL菌液。再加入27 mL新鲜LB液体培养液，用200 μL移液器加入到96孔细胞培养板内，用保鲜膜缠绕，确保96孔板上下两个半壳之间的空隙被密封，在底部放置湿润的毛巾，置于特定的容器内，放在二氧化碳培养箱内，培养48 h。

3.3.3 甘草成分对单增李斯特菌生物被膜eDNA的影响

按上述方法培养生物被膜，用PBS将光甘草定配制成浓度为10 mg/mL。往96孔细胞培养板加入光甘草定使终浓度为10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，同时做空白对照孔，每孔重复3次，作用6 h后按Rice等介绍的方法提取并检测eDNA。

（1）加入0.5M EDTA预冷1 h；

（2）用700 μL 50 mM TEN缓冲液重悬生物被膜，转入预冷的离心管中，4°C，18000 rpm离心5 min；

（3）将上清转入新的离心管，加入300 μL TE缓冲液，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25： 24： 1）；

（4）4°C，12000 rpm离心10 min，取上清，用氯仿：异戊醇（24：1）再次萃取；

（5）取水相，加入3倍体积的冷乙醇和1/10体积的醋酸钠，混匀后-20°C过夜；

（6）4°C，18000 rpm离心20 min，去上清，用70%冷乙醇洗涤，空气中风干后，加入20 μL TE缓冲液溶解；用NanoDrop 2000分光光度计检测A260/A280的吸光度比。

3.3.4 甘草各成分对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

按上述方法培養单增李斯特菌生物被膜。用PBS将光甘草定配制成浓度为10 mg/mL。往96孔细胞培养板加入光甘草定使终浓度为10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，同时做空白对照孔，每孔重复3次，分别作用2 h、4 h、6 h和8 h后用PBS洗去浮游菌，洗3次，加入0.04%结晶紫染色30 min，用自来水洗去浮色，待膜干后，每孔用200 μL乙醇溶解，于570 nm波长下检测，记录结果。

4 结果及分析

4.1 对单增李斯特菌生物被膜eDNA的影响

eDNA的相对表达量就是对单增李斯特菌生物被膜形成多少的直接反映。图1可以看出，光甘草定对单增李斯特菌生物被膜存在抑制作用，且随着光甘草定浓度的增加，对单增李斯特菌生物被膜的抑制作用逐渐增强（图1）。

4.2 对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

从图2可以看出，光甘草定对单增李斯特菌的生物被膜形成具有抑制作用。随着光甘草定浓度增大，实验数据明显在减小，说明光甘草定浓度增大对单增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用明显增强。同时在某一浓度时，随着时间的延长，光甘草定对单增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用也有所增强。

5 讨论

经过实验，任何实验浓度的光甘草定均表现出的是对单增李斯特菌生物被膜的抑制作用。通过数据的平稳降低和曲线的持续下降，表明光甘草定对生物被膜有持续的影响作用，并且还随着浓度的增加，抑制作用还越来越强。进过近年的实验研究成果观察，抑制的机理可能是影响可细菌的生长。有实验证明，光甘草定对酪氨酸酶的活性有一定的影响作用。因此有可能是在细菌的新陈代谢阶段，某一种或者某几种酶活性受到干扰，导致细菌生长受阻，因此生物被膜的形成被影响。也有可能是的结构到破坏。导致细菌无法完成特定的生理过程，因此无法完成正常的生物被膜的构建。也有很多实验证明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能还有其他的影响生物被膜形成的机理。

6 结论

10～200 μg/mL光甘草定随着浓度的增加对单增李斯特菌生物被膜的抑制作用增强，且随着作用时间延长，抑制作用增强。

参考文献

[1]冯飞飞，张强，王莉，等.毒力基因调控蛋白PrfA促进单核细胞增生李斯特菌生物被膜的形成[J].微生物学通报，2011（9）：1450-1457.

[2]张强，冯飞飞，王莉，等.单核细胞增生李斯特菌SigmaB、PrfA因子对生物被膜形成影响的研究[J].医学研究杂志，2010，39（10）：19-22.

[3]Reniers，Hbraudm，desvauxm. Molecular biology of surface colonization by Listeriam onocytogenes： an additional face to fan opportunistic Gram-positive food borne pathogen[J]. Environ Microbiol， 2010， 13（4）： 835- 850

[4]harmsenm，Lappannm，Knchels， et al. Role of extracelular DNA during biofilm formation by Listeriam onocyto genes[J]. Appl Environ Microbiol， 2010， 76（7）： 2271-2279. ）

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