纤维素分解菌的筛选及其生长条件的研究

路娟娟　陈娴　孔峰　程洁红

摘 要：为筛选出能够降解纤维素的纤维分解菌，为生物质的高效利用提供生物预处理的微生物资源基础。采集土壤样品进行混合并制成一定浓度的菌悬液，经过初筛、纯化和复筛，获得了6株纤维素分解菌，并对这6株菌用英文字母进行编号，分别为菌A、菌B、菌C、菌D、菌E、菌F；同时进行了每种菌的不同温度、不同pH值对纤维素菌酶活力的影响实验，并获得了每种菌的最适温度、最适pH值参数。菌株的最适温度和最适pH值可以为纤维素分解菌用于生产、工程实践方面提供合理的工艺参数依据。

关键词： 纤维素分解菌；筛选；酶活力

中图分类号：Q819.0 文献标识码：A 文章编号：2095-7394（2017）06-0020-05

木质纤维素生物质（所有的植物和植物原料） 是地球上最丰富的且具有巨大的生物能源和大宗化学品生产潜力的可再生有机物质。[1]木质纤维素物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，三者所占的比例分别是40%、20%～30%和20%～30%。[2]由于纤维素结构复杂，又与木质素结合形成难以被高效利用的“木质纤维素”，这一直是限制木质纤维素生物质高效利用的瓶颈。因此，破坏纤维素、木质素的牢固结构，使纤维素、木质素及包裹在其中的有机质成分充分裸露而被利用，是生物质高效利用的前提。目前，用生物方法对生物质进行预处理是既经济又高效的方法。筛选出能够降解纤维素的纤维分解菌，为生物质的高效利用提供生物预处理的微生物资源基础。同时对所筛选出的微生物进行了温适宜度、适宜pH值等生长条件的实验研究。

1 材料及方法

1.1 菌种来源

采集江苏理工学院校园灌木丛下、小树林下腐烂叶子下面的土壤样品，进行混合后制成一定浓度的菌悬液备用。

1.2 培养基准备

（1）赫奇逊噬纤维素基础培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，琼脂25g，水1 000mL[3]。

（2）羧甲基纤维素钠培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，羧甲基纤维素钠10g，琼脂25g ，水1 000mL[4]。

（3）液体发酵培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，稻草20g，水1 000mL[5]。

1.3 羧甲基纤维素酶活性测定

羧甲基纤维素酶活力代表纤维素酶类酶活力的考察指标，其中羧甲基纤维素酶活性测定参照文献[6]中的测定方法。

2 结果及分析

2.1 菌株的选育

2.1.1菌株的初筛

将已经融化的赫奇逊琼脂培养基倒入无菌培养皿中，冷凝成平板，用无菌镊子取直径9cm的沾过赫奇逊培养液的无菌滤纸一张，放在平板上，贴紧；将制作好的土壤菌悬液吸取0.1ml均匀滴加在滤纸上，放在培养箱中28～30℃培养5～7天。

2.1.2菌株的纯化

将初筛滤纸上长出的特征不同的菌落分别接种到羧甲基纤维素钠培养基平板上，经过多次分离纯化，共获得了6株纤维素分解菌，将这6株菌进行显微镜观察，达到纯菌株要求后，再进行纤维素分解菌的复筛。

2.1.3菌株的复筛

将纯化后的6株菌重新接种在铺有无菌滤纸的赫奇逊琼脂培养基上，进行复筛验证实验，复筛后获得6株纯菌株。

2.3 适宜生长条件的确定

2.3.1 适宜温度的确定

向每个250ml三角瓶中分别装入200ml液体发酵培养基，每个温度每种菌设三个平行样，分别接种A菌、B菌、C菌、D菌、E菌、F菌，接种后分别放在28℃、37℃、50℃的摇床上，180转/分进行培养，每天定时取样测定羧甲基纤维素酶活性，共培养6天。

由图1可知，温度为28℃时，菌A的酶活力较低，生长缓慢，在第二天和第五天酶活力达到此温度下相对较高的值，第六天进入衰亡期；温度为37℃时，菌A在第二天和第五天和第四天酶活力达到相对较高的值，并且都高于28℃下的酶活力，第六天进入衰亡期；温度为50℃时，菌A在第一天到第二天期间加速生长，酶活力增强，第二天达到最大值0.1864（mg/（ml·h））。随后进入衰亡阶段，停止生长。第五天以后菌A酶活性又迅速增大。因此菌A最适宜的生长温度为50℃。

由图2可知，温度为28℃时，菌B在第一天开始迅速生长，第二天酶活力达到最大值0.110 4（mg/（ml·h）），第二天以后进入衰亡期，到第四天基本停止生长。温度为37℃时，酶活力基本不会增长；50℃下酶活力在第一天到第二天迅速增长，第二天到第三天迅速下降，第三天以后呈现增长趋势。在生长期内28℃下的酶活性最大，因此菌B最适宜的生长温度为28℃。

由图3可知，在菌C培养的第二天酶活性达到最大值，不同温度下酶活性比较，温度为28℃时酶活力达到最大值0.116 1（mg/（ml·h）），第二天以后進入衰亡期，酶活性随之下降，第四天后又开始生长，酶活性增强。因此，菌C生长最适宜的温度为28℃。

图4 菌D在不同温度下酶活力随时间的变化情况

由图4可知，温度为28℃时，菌D的酶活性比较平稳，基本不产生酶；温度为37℃，第一天到第三天酶活性增加但是比较小，第三天后处于基本稳定的状态，比28℃下的酶活性强一点；温度为50℃时，第一天到第三天，酶活性小幅度增加，第三天到第四天酶活力迅速增强，达到最大值0.2148（mg/（ml·h）），第四天后迅速下降，到第六天基本停止生长。因此菌D生长最适宜的温度为50℃。

由图5可知，菌E在第一天到第二天迅速生长，在第二天达到酶活力的峰值，第二天以后产酶能力下降，到第四天基本停止生长，进入衰亡期。在生长阶段28℃下菌E的酶活力与其他温度下的酶活力比相對较高，因此菌E的生长最适合的温度是28℃。

由图6可知，菌F在28℃下，第二天产酶达到峰值为0.122 6mg/（ml·h），之后酶活力下降到第三天后进入衰亡阶段，酶活力不再变；在37℃下酶活力较低且基本不产酶；在50℃下，菌F在第二天以后迅速生长，产酶能力增强，到第四天达到峰值0.3062mg/（ml·h），第四天后产酶能力下降，直到第六天酶活力降至最低不再生长。不同温度下比较达到的峰值，在50℃下，菌F的酶活力更强，因此菌F最适宜生长的温度是50℃。

2.3.2 适宜pH值的确定

向每个250ml三角瓶中分别装入200ml液体发酵培养基，设置三个pH值：pH4.2、pH6.0、pH7.2；每个温度每种菌设三个平行样，分别接种A菌、B菌、C菌、D菌、E菌、F菌，接种后分别放在28℃的摇床上，180转/分进行培养，每天定时取样测定羧甲基纤维素酶活性，共培养6天。

由图7可知，菌A 在不同pH下的酶活力大小不同。pH为4.2时，菌A在第二天酶活力达到最大值为0.182 8mg/（ml·h），之后一直迅速下降，到第四天酶活力降至最低；pH为6时，酶活力在第三天达到最大值，之后迅速下降；pH为7.2时，菌A在第四天达到最大值，之后迅速下降直至最低。不同pH下酶活力的峰值比较，在pH为4.2时，菌A的酶活力最强，因此菌株A生长最适pH是4.2。

由图8可知，菌B 在不同pH下的酶活力大小不同。pH为4.2时，菌A在第二天和第三天酶活力较高；pH为6时，酶活力在第三天时较高；pH为7.2时，菌B在第四天较高。不同pH下酶活力的峰值比较，在pH为4.2时，菌B的酶活力最强，因此菌B适合生长的pH为4.2。

由图9可知，菌C 在不同pH下的酶活力大小不同。pH为4.2时，菌C酶活力在第三天时较高；pH为6时，酶活力在第三天时较高，为0.076 8mg/（ml·h）；pH为7.2时，菌C在第四天酶活力较高。不同pH酶活力大小比较下，菌C在pH为6时酶活力最大，因此菌C生长最适pH为6。

由图10可知，菌D 在不同pH下的酶活力大小不同。菌D在第三天时酶活力较高，不同pH下比较，当pH为4.2时，菌D的酶活力最大为0.204 4mg/（ml·h），因此菌D生长最适宜的pH 为4.2。

由图11可知，菌E 在不同pH下的酶活力大小不同。当pH为4.2时，酶活力变化不大且较低；当pH为6时酶活力在第四天达到最大值；当pH为7.2时，酶活力在第三天达到最大值0.1169mg/（ml·h）。因此，菌E生长最适宜的pH 为7.2。

由图12可知，菌F在不同pH下的酶活力大小不同。当pH为4.2时，酶活力在第二天达到最大值0.128 2mg/（ml·h）；当pH为6时，相比其他pH下酶活力较低且变化不大；当pH为7.2时，菌F在第四天的酶活力达到最大值且小于pH为4.2时的最大酶活力。因此，菌F生长最适宜的pH为4.2。

3 结 论

（1）通过初筛、纯化和复筛获得了的6株纤维素分解能力较强的纤维素分解菌。

（2）不同的菌株其生长条件不一，菌A的最适生长温度为50℃，最适pH值为4.2；菌B的最适生长温度为28℃，最适pH值为4.2；菌C的最适生长温度为28℃，最适pH值为4.2；菌D的最适生长温度为50℃，最适pH值为4.2；菌E的最适生长温度为28℃，最适pH值为7.2；菌F的最适生长温度为50℃，最适pH值为4.2。菌株的最适温度和最适pH值可以为纤维素分解菌用于生产、工程实践方面提供合理的工艺参数依据。

参考文献：

[1] Rastogi G， Bhalla A， Adhikari A， et al. Characterization of thermostable cellulases produced by Bacillus and Geobacillus strains [J]. Bioresource Technology， 2010，101：8798 -8806.

[2] Tegerdy R P， Szakacs G. Bioconversion of lignocellulose in solid substrate fermentation[J].Biochemical Engineering， 2003，13（2/3）：167-179.

[3] 姚占芳，吴云汉.微生物学实验技术[M].北京：气象出版社.1998：187.

[4] 周群英，王士芬.环境工程微生物学[M].第3版.北京：高等教育出版.2008：446.

[5] 孙晓华，罗安程.纤维素分解菌的分离、筛选及其环境适应性初步研究[J].科技通报，2005，21（2）：236-241.

[6] 刘士清，刘伟伟，马欢等.农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨[J].农机化研究，2008，5（10）：162-163.

Screening of Cellulose-decomposing Microorganisms and Their Growth Factors

LU Juan-juan， CHEN Xian， KONG Feng， CHENG Jie-hong

（School of Chemical and Environmental Engineering， Jiangsu University of Technology， Changzhou， 213001， China）

Abstract： We collected the soil samples， mixed these samples and dispensed the certain concentration of microorganism suspension. By the first screening， purification and the second screening， six strains of cellulose-decomposing have been obtained. The six strains were named strain A， strain B， strain C， strain D， strain E， strain F in accordance with English letters. The experiment had been done about the influence of the different temperature and the different pH value to each strain. The optimum temperature and the optimum pH value of the six strains have been obtained.

Key words： cellulose-decomposing microorganisms； screening； enzyme activity

责任编辑 赵文清