干旱胁迫下桑树叶片中超氧阴离子的变化规律

任迎虹 刘松青 祁伟亮 罗翠华 龚壁燃 欧莉萍

摘要： 该研究以6个四川桑树品种为对象，对供试桑树品种进行连续的人工干旱处理，利用生理方法明确保护酶系（SOD）的变化规律，并采用硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验进行超氧阴离子O-2·组织化学的可视化检测。结果表明：随着干旱胁迫的加剧，SOD的含量明显高于对照组，其中SOD活性呈先升后降的变化趋势，而超氧阴离子一直呈加重的趋势。6个桑树品种的SOD 含量从正常到中度胁迫都呈现不同程度的上升趋势，上升趋势明显的品种是九龙拐和湖桑32，上幅分别为62.7%和60.1%，其次是云桑1号和荷叶白一号上幅，分别为52.2%、58.2%，油桑和充桑的上幅为50.8%和47.4%，说明SOD正发挥着积极的作用。在中度胁迫之后SOD 的含量与活性氧的水平表现出相反的趋势，原因可能是随着干旱胁迫的加剧，O-2·达到最大值且超出一定域值，从而导致SOD活性的降低。通过电镜观察发现，超氧阴离子由叶脉向周围扩散，同时面积逐渐增大。其中，抗旱性强的品种湖桑32叶片表面茸毛比较长，且基部膨大，端部有明显的刺状突起，而抗旱性弱的品种荷叶白1号叶片表面茸毛比较细短且端部的刺状突起不明显，因此推测叶片表面茸毛的特性与抗旱性存在一定关系。

关键词： 桑树， 干旱胁迫， 超氧化物歧化酶， 超氧阴离子， 叶片表面茸毛

中图分类号： Q945.78， S888.2文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09112208

Abstract： We used six mulberry varieties in Sichuan Province as the research object， by using physiological method and used NBT test to determine the activities of SOD and to study the changes of super oxygen anion （O-2·） in the leaf blade tissues under different drought conditions. The results showed that the SOD content of six mulberry varieties were significantly higher than those of the controls. The change trend of SOD activity was raised and then fell later， and super oxide anion grew steadily. Possible reasons were that reactive oxygen beyond a certain threshold， which led to SOD activity decreased. Under different drought conditions， from normal stress treatment to middle stress， the SOD content of six mulberry varieties also demonstrated rapid growth. Jiulonggui and Husang 32 showed a rising trend and increased by 62.7% and 60.1% obviously； followed by Yunsang 1 and Heyebai 1 raised to 52.2% and 58.2%； Yousang and Chongsang were increased to 50.8% and 47.4%， respectively. This showed that the SOD played an active and effective role to reduce O-2·. After moderate stress level of SOD and active oxygen showed the opposite trend， which showed significant degradation effect， and had a mechanism of active oxygen injury. Super oxide anion spread around the veins， area of super oxide anion gradually increased， which were observed by transmission electron microscope. It is obeserved that Husang 32 has its ability to eliminate the superoxide free radical， and its drought resistance abilities and leaf blade surface hairs were higher than that of Heyebai 1. Hence， it can be inferred that the length of leaf blade surface hairs has a certain relationship with drought resistance.

Key words： mulberry， drought stress， superoxide dismutas， super oxygen anion， leaf blade surface hairs

桑树属桑属（Morus L.）桑科（Moraceae），我国约15个种，分布于北温带，属于多年生的双子叶落叶乔木，具有食用、药用、材用及观赏等多种利用价值，是一种重要的经济作物（秦俭等，2010）。蚕桑产业是四川传统特色产业，是四川省重点发展的“十大”农业产业之一。而干旱是桑树种植最主要的非生物胁迫因素，严重影响桑叶的产量和品质。植物在受到干旱胁迫时会发生PSII和PSI的光抑制现象，而PSI的光抑制现象与活性氧（ROS）的产生紧密相关（Liu et al， 2004； Asada， 2006）。体内活性氧含量的增加，如过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O-2·），对植物的生长会产生不利影响（Strid et al， 1994； Yu et al， 2006； Pradedova et al， 2011）。因此，植物在干旱或者鹽胁迫下正常生长的关键是控制叶绿体中活性氧的平衡（Tseng et al， 2007）。为防止超氧化物对细胞体的破坏，植物将启动酶和非酶的防御系统来有效清除活性氧，以保护细胞膜等免受氧化伤害，从而有利于维持其他生理代谢的正常进行 （Prochazkova et al， 2001； Gutteridge & Halliwell， 2010）。其中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用（Kim et al， 2010），SOD通过歧化反应把O-2·转化为H2O2，H2O2再被过氧化氢酶和氧化物酶转化为H2O，从而达到清除细胞内氧自由基，来缓解植物受到的逆境胁迫（Tian & Lei， 2007； Miller et al， 2010）。因此，抗氧化酶的活性与植物的抗逆性强弱有关（Kochhar & Kochhar， 2005）。应朝阳等（2006）、谢亚军等（2008）和陈珺（2013）分别采用不同的植物花生、甘草以及四种观赏植物红叶石楠、小叶黄杨、金叶女贞及大叶黄杨，研究土壤干旱胁迫下对活性氧代谢及保护酶活性的影响变化规律。任迎虹（2009）研究报道在干旱条件下桑树保护酶活性随干旱胁迫的加强而提高。

前人研究当中经常使用紫外—可见吸收分光光度的方法，进行检测O-2·，但此法难以准确用于O-2·的定性分析。Donahue（1997）和Liang et al（2003）利用硝基四氮唑蓝（NBT）还原法进行O-2·的组织化学定位， 此法测定灵敏度高。廖展如等（2003）模拟干旱胁迫利用NBT还原法，对水稻、棉花、小麦、玉米、油菜、花生等作物进行O-2·组织化学检测、光镜及电镜观察。在桑树抗逆性研究中，利用硝基四氮唑蓝还原法进行O-2·的研究报道比较少。因此，本研究以6个四川桑树品种为研究对象，进行干旱胁迫处理，利用生理生化方法来明确活性氧（O-2·）及保护酶系（SOD）的变化规律，釆用电镜细胞化学标记技术在亚细胞水平上对O-2·的空间分布进行定位，以研究活性氧在不同干旱胁迫下的变化规律，这为细胞学研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1 材料

供试材料充桑，荷叶白1号，九龙拐，油桑，湖桑32号，云桑1号。均采集于四川省西昌市蚕种场品保园，其中旱地对照材料为湖桑32号。

1.2 方法

1.2.1 干旱胁迫处理2015年4月室内模拟干旱条件对种子进行发芽后盆栽， 土壤混合比例（土壤∶营养土为1∶1）。7月，苗木高度在40 cm左右时，选择长势相对一致的苗木，对供试桑树品种进行连续的人工干旱处理。实验分成试验组和对照组，每个品种为12盆，待各品种桑树生长正常后，选取长势基本一致的于5月初对试验组进行水分胁迫。将干旱和对照处理均浇透水后再分别处理，试验组停止浇水，自然失水，对照组每隔2 d浇一次水，每次每盆1 500 mL。

分别于土壤干旱处理后7、l4、21 d后的早上8：00取上部同叶位叶片，进行各项指标的测定，三次重复。测得田间最大持水量为34.85%，据此设为正常处理（含水量为85%～100%）、轻度干旱（含水量为65%～75%）、中度干旱（含水量为50%～65%）、重度干旱（含水量为30%～45%）。

1.2.2 O-2·组织化学检测和SOD活性测定方法O-2·的可视化检测方法是按照Wang et al（2011）的方法，作微小修改进行，选取抗旱性强的品种湖桑32和抗旱性弱的品种荷叶白1号进行电镜观察，观察超氧阴离子在细胞内部的变化规律。SOD活性测定参考Beauchamp & Fridovich （1971）的测定方法。

1.2.3 数据统计分析所有数据均为3次重复的平均值，采用EXCEL和SPSS软件（王满莲等，2014）进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1 超氧化物歧化酶的活性变化

随著干旱胁迫的加剧，SOD活性呈先升后降的变化趋势，在各胁迫处理水平下，6个桑树品种的水分含量变化存在显著差异（P<0.05）。从CK到中度，各品种在干旱胁迫下持续升高并达到最大值（图1），上升趋势明显的品种是九龙拐和湖桑32，分别升高了62.7%和60.1%，其次是云桑1号和荷叶白一号，分别升高了52.2% 、58.2%，油桑和充桑的分别升高了50.8%和47.4%，表明湖桑32和九龙柺的活性氧清除能力比较强。从中度到重度，SOD活性呈下降趋势，各品种SOD活性从弱到强依次是荷叶白1号<油桑<充桑<云桑1号<九龙柺<湖桑32。这说明自由基活性氧浓度未超过伤害“阈值”时，保护酶SOD活性会表现出积极应对；而超过“阈值”后，保护酶SOD活性下降，从而进一步促使了膜脂过氧化。

2.2 胁迫条件下对活性氧积累的影响

随着干旱胁迫的加剧，超氧阴离子的蓝色斑点聚合产物面积呈上升的变化趋势，面积越大表明植物对干旱胁迫的防御机制越差，抗旱性能力就越低。在正常处理水平下，6个桑树品种的超氧阴离子蓝色斑点聚合产物均有少量的积累，表明叶片本身也存在少量的超氧阴离子（图2：a、e、i、m、q、u）。轻度处理下，6个桑树品种的超氧阴离子的蓝色斑点积累产物面积比较小且数目开始增加（图2：b、f、j、n、r、v）。中度处理下，6个桑树品种的超氧阴离子的蓝色斑点积累产物主要集中在叶脉附近，斑点面积增大，且数目开始增加（图2：c、g、k、o、s、w）。在重度干旱胁迫处理下，超氧阴离子（O-2·）的蓝色斑点积累产物面积增大，且色度加深，其中湖桑32和九龙拐的的蓝色斑点产物比较少（图2：d、h），云桑1号和充桑的次之（图2：l、p），荷叶白1号和油桑的最多（图2：t、x）。这表明随着干旱胁迫的加剧湖桑32和九龙拐的自身防御机制比较强，抗旱能力比较好，云桑1号和充桑次之，荷叶白1号和油桑的抗旱能力较弱。

2.3 干旱胁迫下对超氧阴离子的叶片表皮细胞化学定位观察

随着干旱胁迫的加剧，超氧阴离子的蓝色斑点积累产物主要集中在叶脉附近，斑点面积逐渐增大，叶脉茸毛中的超氧阴离子积累也随之发生变化。在正常处理下，叶脉和细胞表面的蓝色斑点积累产物较淡（图3：a、e），其中抗旱性强的湖桑32叶脉茸毛较长且呈透明状，抗旱性弱的荷叶白1号叶脉茸毛较短（图4：a、e）。在轻度处理下，叶脉中不同部位出现淡蓝色斑点积累产物，叶脉茸毛末端部位有淡蓝色的产物积累，表明超氧阴离子的积累相对比较少（图3：b、f，图4：b、f）。在中度处理下，叶脉部位的蓝色斑点积累产物加深，细胞表面茸毛周围的超氧阴离子逐渐增多，而叶脉茸毛中的超氧阴离子蓝色斑点积累达到最大（图3：c、g，图4：c、g）。在重度处理下，细胞表面的超氧阴离子的积累产物面积增大，其中湖桑32在细胞表面及茸毛部位中的蓝色斑点面积区域增大且茸毛部位尖端呈透明状（图3：d，图4：d）；而荷叶白1号超氧阴离子的蓝色斑点面积颜色较深、茸毛数量多颜色比较深（图3：h，图4：h），这表明抗旱性强的品种湖桑32超氧阴离子的清除能力比较强，荷叶白1号比较弱。

3讨论

3.1 干旱胁迫下超氧化物歧化酶的活性变化

夏慧莉等（1999）研究表明，细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累能诱导细胞发生凋亡。通常细胞内有一系列有效的抗氧化防御机制，包括清除ROS的SOD、CAT、POD等，其中，SOD 是抵御活性氧自由基介导的氧化损伤的第一道防线，是抗氧化酶系统中的关键酶，SOD 能以O-2·为基质进行歧化反应（任永波等，2001）。随着干旱胁迫的加剧，一旦活性氧水平超出一定域值，自由基产生与清除间的平衡失调，就会导致 SOD 酶活性的降低（林永英2002）。在本研究中，随着干旱胁迫的加剧，SOD 活性总體呈现先上升后下降的变化趋势，超氧阴离子一直呈加重的趋势，6种桑树SOD 活性变化与张旭颖等（2010）和陈珺（2013）的测定结果一致。SOD 的含量在中度胁迫下达到最大，说明SOD发挥着积极的作用。在中度胁迫之后SOD 的活性与活性氧的水平表现出相反的趋势，原因可能是在重度处理下活性氧达到最大值，超出一定域值，从而导致抗氧化酶活性的降低。

3.2 超氧阴离子在细胞中的分布规律

叶脉系统是叶片里重要的水分输导系统，也是运输养分和光合产物的通道。叶脉密度和叶脉直径等， 共同决定着叶脉系统的水力导度（Sack et al，2013）。随着干旱胁迫加剧，超氧阴离子蓝色斑点积累产物最先出现在叶脉中，并且面积区域逐渐增大，其可能原因是土壤水分缺失，叶片中叶脉区域最先表现出超氧阴离子的积累，这与叶脉的疏导性存在一定的关系。段喜华等（2003）认为，叶片表皮毛数量较多，可以减少空气流对气孔的影响，也减少叶表蒸腾，因此，叶表皮茸毛在一定程度上反映植物的抗旱能力和抗逆特性。赵述文等（1991）通过大豆不同抗旱性品种叶片电镜观察，发现抗旱性强的品种叶片茸毛粗而长，茸毛基部膨大，抗旱性弱的品种茸毛细而短，上面的刺状突起不明显。该研究通过电镜观察及O-2·的叶片、叶脉表皮细胞化学定位观察，研究结果表明茸毛部位的超氧阴离子积累由基部向端部扩散，抗旱性强的品种湖桑32叶细胞表面茸毛比较长且端部比较尖。随着干旱胁迫的加剧，在重度处理下，湖桑32叶脉中超氧阴离子积累蓝色斑点产物颜色变浅，在茸毛的细胞基部和端部呈透明状、中部颜色加深，这表明湖桑32的氧自由基的清除能力比较强。而抗旱性弱的品种荷叶白1号，叶脉表面茸毛比较短，超氧阴离子积累蓝色斑点产物颜色并未发生明显变化。推测随着干旱胁迫的加剧，细胞表面茸毛越长能够减少叶表蒸腾，同时对超氧阴离子的清除能力比较强，从而表现出较好的抗旱性。

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