超声波提取法与水煎提取对五倍子体外抑菌效果的影响

李泽英 黄翔 刘北华 潘进良

摘要：本实验以五倍子作为试供药物，黄芩为对照组，研究超声波与水煎提取对五倍子体外抑菌效果的影响，采用平皿打洞法测定五倍子对金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌等四种常见禽畜致病菌的体外抑菌活性，并用二倍稀释法测定五倍子对四种细菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。试验结果显示：与水煎法相比较，超声波提取法对五倍子体外抑菌效果的提高并不明显。

关键词：五倍子；水煎法；超聲波提取法；体外抑菌

中图分类号：S859 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）09-0006-01

1研究的目的和意义

通过比较超声波与水煎提取方法对五倍子的体外抑菌效果，为超声波提取其他中药材提供一定的试验依据。

2研究方法

2.1药液制备

水煎提取法：分别称取五倍子、黄连、黄芩各10g，加蒸馏水100mL，浸泡30min，再将药材连同浸泡的水置于高压锅内用102℃，蒸煮20min，之后将蒸煮液过滤到另一个烧杯中，再往药渣的烧杯中加入蒸馏水100mL，再次置于高压锅中用102℃，蒸煮20min，第2次过滤蒸煮液，然后合并2次蒸煮液，用离心机进行离心，离心速度是4000r/min，离心10min，取上清液进行浓缩，制备成药液浓度为1g/mL的蒸煮液，然后置于高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度120℃，灭菌时间30min，最后用牛皮纸封口，放置在4℃的冰箱中备用。

超声波提取法：分别称取五倍子、黄连、黄芩各10g，加蒸馏水100mL，浸泡30min，再将药材连同浸泡的水置于超声波提取器中，用20kHz频率提取20min，之后将提取液过滤到另一个烧杯中，再往药渣的烧杯中加入蒸馏水100mL，再次置于超声波提取器中，用20kHz频率提取20min，第2次过滤提取液，然后合并两次提取液，用离心机进行离心，离心速度是4000r/min，离心10min，取上清液进行浓缩，制备成药液浓度为1g/mL的提取液，然后置于高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度120℃，灭菌时间30min，最后用牛皮纸封口，放置在4℃的冰箱中备用。

2.2抑菌活性测定

采用平皿打孔法测定供试菌株对供试中药敏感度，具体操作步骤：先在无菌平皿中倒入3～4 mm厚的营养琼脂，待琼脂冷却凝固后，用灭菌棉签蘸取供试菌液均匀涂布在琼脂表面，再用无菌玻璃打孔器（直径6mm）在平皿内均匀打5个孔，然后用灭菌针头除去孔内琼脂并适当封闭孔底，最后用灭菌注射器加入供试药液，以满而不溢为宜，做好标记后置于37℃恒温培养18～24 h，观察结果。若有抑菌作用，则小孔周围出现无细菌生长的抑菌圈，用游标卡尺测量度抑菌圈直径。抑菌圈直径小于10mm为耐药，10～15mm为中度敏感，大于15mm为高度敏感。

同样方法做2个平行测定，并计算抑菌圈平均值，剩下的一个孔不加药液做空白对照。

2.3最小抑菌浓度测定

在超净工作台中取无菌试管8支，1号管中加入1.8mL营养肉汤，2～8号管中各加入1mL营养肉汤，用移液枪吸取已经制备好的浓缩药液0.2mL，加入1号管中混匀后，在1号管中吸取1mL混合液加入2号管中混匀，再在2号中吸取1mL混合液加入3号管中，依次倍比稀释至7号管，混匀后自7号管中弃去1mL混合液，8号管不加菌液作为空白对照管。此时，各管药液浓度分别为100.0mg/mL、50.0mg/mL、25.0mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.5625mg/mL、0mg/mL。将肉汤培养8h的菌液，用无菌肉汤稀释至10～3浓度，然后各管均加入菌液0.2mL，混匀后，置于37℃恒温箱培养18h，观察结果，若肉汤混浊，表示菌液生长，若肉汤清亮，表示无细菌生长。

2.4最小杀菌浓度测定

将上述MIC测定中2～7号管中的肉汤接种于营养琼脂平板上，做好标记，置于恒温箱中37℃培养18h，观察结果，以平板中有无菌株生长为标准，以无菌株生长的最低浓度作为该药的最小杀菌浓度（MBC）。

3试验结果

3.1抑菌活性的测定结果

除多杀性巴氏杆菌外，超声波提取法均提高了五倍子对其他试供菌的体外抑菌效果；五倍子的超声波提取液对埃希氏大肠杆菌呈高度敏感，而其水煎液仅仅呈现中度敏感；对埃希氏大肠杆菌和沙门氏菌，五倍子超声波提取液抑菌效果的提高较为显著。除沙门氏菌外，超声波提取法均提高了黄芩对其他试供菌的体外抑菌效果。

3.2最小抑菌浓度（MIC）的测定结果

超声波提取法仅降低了五倍子对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，而对其他3种细菌的最小抑菌浓度没有影响。超声波提取法降低了黄芩对埃希氏大肠杆菌的最小抑菌浓度，不能确定是否影响了黄芩对金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌的最小抑菌浓度测定。

3.3最小杀菌浓度（MBC）的测定

超声波提取法仅降低了五倍子对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度，而对其他3种细菌的最小杀菌浓度没有影响。黄芩水煎液的最小杀菌浓度要比超声波提取液的最小杀菌浓度小，不能确定超声波提取法是否影响了黄芩对多杀性巴氏杆菌的最小杀菌浓度。

相对于水煎法，超声波提取法对五倍子体外抑菌效果的提升并不明显。

参考文献

[1]赵丽东， 张华峰， 董静洲， 等. 淫羊藿苷的超声波强化提取及其稳定性初探[J]. 西北农业学报， 2007， 16（6）： 285-288.