基于MAPK通路研究五味甘露药浴散加减方治疗类风湿关节炎的药效机制

左芳　韦婷　童东　张艺　陈小睿　曾勇

[摘要] 研究发现五味甘露药浴散加减方药浴有良好的抗炎活性，可以明显改善关节炎症程度，对类风湿性关节炎具有一定的治疗作用，推测其可能与调控滑膜细胞MAPK通路有关。该实验通过建立佐剂关节炎大鼠（AA）模型，进一步探讨其调控滑膜细胞MAPK通路的机制。采用酶联免疫法测定给药2周AA大鼠血清中TNFα的水平，免疫组化法测定给药4周踝关节滑膜组织蛋白激酶ERK1/2，p38的含量，采用荧光定量PCR（RTPCR）法检测膝关节滑膜组织中JNK1，ERK1，p38的mRNA表達。结果显示，与模型组比较，给药2周，可明显降低AA大鼠血清中TNFα的水平（P<0.05）；给药4周，降低踝关节滑膜组织中p38，ERK1/2的蛋白表达（P<0.05或P<0.01），降低膝关节滑膜组织JNK1，p38，ERK1的基因表达（P<0.05或P<0.01）。综上可见，五味甘露药浴散加减方有效治疗类风湿关节炎的作用机制可能与其降低血清中TNFα的水平和滑膜组织中p38，ERK1/2的表达以及JNK1，p38，ERK1的基因表达，调控MAPK通路有关。

[关键词] 五味甘露药浴散加减方； 佐剂型关节炎； TNFα； ERK1/2； JNK1； p38MAPK

Pharmacodynamic mechanism of modified Ganlu Yaoyu San intreatment of

rheumatoid arthritis based on MAPK signaling pathway

ZUO Fang， WEI Ting， TONG Dong， ZHANG Yi*， CHEN Xiaorui， ZENG Yong

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] According to the findings， modified Ganlu Yaoyu San has a good antiinflammatory activity， and can significantly alleviate the degree of arthritis. Its therapeutic effect for rheumatoid arthritis may be related to the regulation of MAPK pathway of synovial cells. In the study， the rat adjuvant arthritis（AA） model was established to further investigate the pharmacodynamic mechanism for regulating MAPK pathway of synovial cells. Enzymelinked immune assay was used to determine the serum TNFα level of AA rats administered with drug for two weeks， synovial tissue protein kinases ERK1/2 and p38 content were determined by immunohistochemistry， synovial tissue JNK1， ERK1， p38 gene（mRNA） expression were detected with fluorescence quantitative PCR（RTPCR） method. According to the results， after administration for two weeks， the levels of serum TNFα of AA rat was significantly decreased（P<0.05）. After administration for four weeks， the protein expressions of p38 and ERK1/2 in synovial tissue were reduced（P<0.05 or P<0.01）， the gene expressions of JNK1， p38 and ERK1 in knee joint synovial tissue were reduced（P<0.05 or P<0.01）. In conclusion， modified Ganlu Yaoyu San can effectively treat rheumatoid arthritis. Its mechanism might be related to the reduction of TNFα levels in serum， protein expression of p38 and ERK1/2 in synovial tissue， and JNK1， p38 and ERK1 gene expressions， and regulation of MAPK pathway.

[Key words] modified Ganlu Yaoyu San； adjuvant arthritis； TNFα； ERK1/2； JNK1； p38MAPK

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因未明的慢性破坏性关节病变疾病，属于全身性自身免疫性疾病，以对称性、进展性、多关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现[12]。藏药浴疗法是藏医治疗风湿、类风湿性关节炎的常用手段[3]。五味甘露方是藏药浴的基础配方，最早记载于藏医经典巨著《四部医典》[4]。临床应用最多的是五味甘露药浴散加减方。研究表明五味甘露颗粒能抑制各种炎症模型所致炎症[5]，尤其对寒湿痹阻型类风湿关节炎疗效显著。韦婷等[67]通过建立大鼠AA模型，研究五味甘露药浴散加减方的抗炎活性，结果表明其能有效减小AA大鼠致炎侧足跖肿胀度，改善致炎侧踝关节滑膜病理改变，提示五味甘露药浴散加减方药浴有良好的抗炎活性，对类风湿性关节炎具有一定的治疗作用。研究发现，细胞间网络信号通路转导异常引发的滑膜、关节等全身结缔组织的破坏和解聚是RA主要的病理基础，滑膜细胞的信号通路异常转导是其重要的发病机制之一[810]。滑膜细胞的过度异常增生、凋亡受阻和炎症细胞的激活、浸润是导致关节滑膜炎症持续存在的原因，丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号转导通路中的各种信号蛋白激酶都不同程度的参与了以上病理过程[1112]。故本实验在前期研究基础上拟通过建立AA模型，基于MAPK通路进一步探讨五味甘露药浴散加减方治疗类风湿关节炎的相关药效机制。

1 材料

1.1 动物 雄性SD大鼠（SPF级），体重（200±20） g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）201324。

1.2 药品与试剂 受试药物：五味甘露药浴散加减方由西藏藏医学院制备，外观为棕褐色固体粉末，有刺鼻香味。经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为五味甘露药材。方药组成：刺柏叶Folium Junipfri 500 g，水柏叶Myricaria pulcherrima 500 g，麻黄Ephedrae Herba 500 g，大籽蒿Artemisia sieversiana 500 g，青稞Hordeum vulgare Linn 100 g，峨参Anthriscus sylvesteis 10 g，喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica Edgew.Heim 10 g，蒺藜Tribulus terrestris 10 g，黄精Polygonati Rhizoma 10 g，乳香Olibanum 10 g，天冬Asparagus cochinchinensis 10 g，决明子Cassiae Semen 10 g，黄葵子Belmoschus manihot L.Medic 10 g，碱花Saponaria officinalis 10 g，甘松Nardostachys chinensis Batal 10 g，岩精Bragzhun 10 g，寒水石Gypsum Rubrrum 10 g，黄硫磺Sulfur 10 g。功能发汗解表，消炎，平黄水，舒筋通络，活血止痛。临床上常用0.04 g·mL-1药液浸泡全身或组织。药液制备：将五味甘露药各取等份同时放入容器中，注入开水，浸泡1夜后，拌匀，加热、煮沸，至水分全部吸入药材中。发酵药物冷却至与皮肤温度相近时加入酵母或酒糟，重新装入容器内并密封，置20 ℃左右的室内发酵3 d后，闻之，既有酒味，又有酸味和药味时即可。发酵好的药材中加入适量水，放置1 d，提取出药液，如此连续操作3次，至第3天把3份提取液混合即可。

醋酸地塞米松（国药准字H33020822，批号130123，浙江仙琚制药股份有限公司，规格0.75 mg/片）；完全弗氏佐剂（Freund′s adjuvant complete，Sigma公司，批号#SLBF 9338V，规格1 g·L-1灭活结核杆菌）；卡介苗冻干粉（上海瑞楚生物科技有限公司，批号201409，规格60 mg/支）。TNFα ELISA试剂盒（批号YAD2015090302，北京雅安达生物技术有限公司）。

JNK1抗体，兔多克隆抗体，批号ab199380（德国默克集团密理博中国有限公司）；p38MAPK抗体，兔多克隆抗体，批号ab197348（德国默克集团密理博中国有限公司）；ERK1/2抗体，兔多克隆抗体，批号ab184699[英国abcam艾博抗（上海）贸易有限公司]；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L），批号13152A11；三抗：辣根酶标记链霉素卵蛋白素（HRP/AV），批号13152A11；山羊血清，批号13152A11；显色剂：浓缩型DAB试剂盒，批号K135925C，均由北京中衫金桥生物有限公司提供。

Trizol（Ambion公司，货号15596026）；SYBR Green PCR试剂盒（TAKARA公司，货号RR420Q）；逆转录试剂盒（TAKARA公司，货号639505）；RNaseⅠ（Fermentas公司，货号AM2295）。PCR引物由南京金斯瑞合成。

1.3 仪器 2015型转轮式切片机[德国徕卡（Leica）仪器有限公司]；ImagePro Plus 6.0 图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪（美国Thermo公司）； Motic Images Advanced图像分析软件；T100Thermal Cycler PCR仪（BIORAD）；荧光定量PCR仪（RealTime System，BIORAD）；水平电泳设备DYC31D（BIORAD）；凝胶成像系统Universal Hood II（BIORAD）。

2 方法

2.1 AA大鼠模型的建立及給药 SD健康大鼠60只，适应性饲养1周后，随机选取10只作为正常对照组，其余50只于大鼠右后足跖皮内每只每次注射0.1 mL弗氏完全佐剂致炎，正常组在右侧后肢足跖皮下注射0.1 mL生理盐水，用足趾容积测量仪测量致炎前大鼠右后足足容积（mL）2次，取其平均值作为致炎前正常足容积作为基础值。16 d后大鼠继发性关节炎症状出现，成功诱发AA大鼠模型。将AA大鼠随机分为模型组、地塞米松组、五味甘露药浴散加减方高剂量组（104.00 g·L-1） 、中剂量组（52.00 g·L-1） 、低剂量组（26.00 g·L-1）。

五味甘露药浴散加减方高、中、低剂量组每天药浴，将大鼠固定在大鼠固定器内，用橡皮筋将固定器固定在底部直径约32 cm，高为21 cm左右的木桶内壁上，使大鼠后肢浸泡在2 L的药液中[高剂量组（104.00 g·L-1）、中剂量组（52.00 g·L-1）、低剂量组（26.00 g·L-1）]，将木桶放在直径约60 cm装有水的大水盆里，电热棒加热大水盆里的水使木桶中水温控制在（40±1） ℃，每天药浴1次，每次30 min。模型组和对照组每天同体积温水浴，条件同药浴组，地塞米松组每天（0.150 mg·kg-1）灌胃1次，连续给药4周。

2.2 AA大鼠血清中炎性细胞因子的测定 给药第14天，大鼠后眼眶静脉取血1.5 mL，静置10～20 min，

于3 000 r·min-1下离心10 min，分离血清，采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书，测定大鼠血清中细胞因子TNFα的含量。

2.3 AA大鼠踝关节滑膜组织ERK1/2，p38表达的测定 免疫组化法测定大鼠踝关节滑膜组织ERK1/2，p38的表达，给药4周，大鼠麻醉取血处死，剪下致炎侧足踝关节，用10%甲醛固定，不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，采用SP免疫组化法，一抗稀释比为1∶200，显色后中性树胶封片。切片染色后，阳性表达颜色为浅黄色或棕黄色，表达主要集中在细胞浆、细胞膜或间质等，阴性表达为蓝色，底色为白色。

2.4 RTPCR法测定受试药物对AA大鼠膝关节滑膜组织JNK1，ERK1，p38基因表达的影响 给药结束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，腹主动脉取血处死固定，钝性分离关节囊的纤维层和滑膜层，无菌剥离完整滑膜组织，称量，放入1.5 mL EP管中，加入质量10倍体积的RNAlater备用。cDNA链合成：按逆转录试剂盒说明书操作。取上述反转后的cDNA，进行PCR扩增。引物序列包括：JNK1的上游引物5′TTTGGAGGAGCGAACT3′，下游引物5′GTCTGTATCCGAGGC3′；ERK1的上游引物5′GGGGTCTCCTCGTTCA3′，下游引物5′AGCCCTTCCATTCCA3′；p38的上游引物5′ CAGGGTAGTGGAGTGAT3′，下游引物5′CGTAAGGGACAGGAAT3′。

2.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理分析，所有指标结果均以±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 给药14 d大鼠血清中细胞因子TNFα的含量 与正常组比较，模型组大鼠血清中TNFα含量明显升高（P<0.05）。与模型组比较，地塞米松组大鼠血清中TNFα含量明显降低（P<0.05）；五味甘露药浴散加减方高剂量组大鼠血清中TNFα含量明显降低（P<0.05），见表1。

3.2 AA大鼠踝关节滑膜组织ERK1/2，p38表达的测定 与正常组相比，模型组大鼠滑膜组织p38，ERK1/2蛋白含量明显升高（P<0.01），与模型组相比，地塞米松组大鼠滑膜组织p38，ERK1/2蛋白含量明显降低（P<0.01或P<0.05）；五味甘露药浴散加减方中剂量组大鼠滑膜组p38，ERK1/2蛋白含量降低（P<0.05），五味甘露药浴散加减方高剂量组大鼠滑膜组织p38，ERK1/2蛋白含量明显降低（P<0.01），见表2、图1，2。

3.3 五味甘露药浴散加减方对AA大鼠膝关节滑膜组织JNK1，ERK1，p38基因表达的影响 模型组大鼠膝关节滑膜中JNK1，ERK1，p38基因mRNA表达量均较正常组显著升高（P<0.01）；与模型组比较，地塞米松组和五味甘露药浴散加减方高、中剂量组JNK1，p38表达量显著降低（P<0.01），五味甘露药浴散加减方低剂量组JNK1，p38表达量有降低趋势（P<0.05），各给药组ERK1表达量显著降低（P<0.01），见图3。

4 讨论

RA是一种以全身多关节慢性滑膜炎症为主要表现的常见自身免疫性疾病。目前治疗RA的药物主要集中在非甾体抗炎药、肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂等，但都普遍存在不良反应较多，患者耐受性差等特点，且以缓解症状为主[13]。五味甘露药浴疗法是水浴疗法和药物疗法的结合，采用藏区道地药材制成药液，将病体浸泡于温热药液中洗浴，利用水的温热作用，打开人体毛孔、疏通人体经络，使药物的有效成分迅速透皮渗透吸收，直达病所，再通过发汗祛风将病毒排出体外，从而达到祛病强身的目的。由于RA发病原因和机制仍未完全明确，无特效治疗措施，所以构建和应用合适的RA动物模型是筛选临床治疗RA药物、考察其治疗有效性和作用机制的研究基础。目前比较常用的RA动物模型主要有4种，其中AA模型的制备方法简单，成功率较高，发病快，足跖肿胀明显，有大量炎细胞浸润，病理学改变与RA临床表现相似，并结合课题组前期研究等各方面因素，考虑选择使用AA大鼠模型。

细胞因子作为免疫调节介质在RA的发展过程中发挥着重要作用，TNFα由活化的单核/巨噬细胞分泌，能够促进细胞生长以及参与免疫调节，具有多种炎性和免疫反应生物活性，是RA滑膜炎症反应中重要的关键性细胞因子，几乎所有RA炎症环节都有它们的参与。两者常同时分泌合成，相互影响，可促进炎性细胞浸润、滑膜组织和新血管增生，血管翳形成，引起骨和软骨破坏，关节肿胀、疼痛[1415]。TNFα可激活RA滑膜细胞分泌细胞黏附分子、胶原酶、环氧化酶、基质金属蛋白酶、前列腺素E2（PGE2）等致炎因子，进而促进成纤维样滑膜细胞的活化、破坏关节组织以及参与关节炎性破坏过程。从本实验结果可以看出，AA大鼠在给予五味甘露药浴散加减方14 d后，其血清中的TNFα较模型组明显降低，五味甘露药浴散加减方有较好的抗炎作用。

RA过程涉及多细胞间信号网络通路的调控，促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPKs）是細胞浆内一类高度保守的丝氨酸蛋白激酶，为细胞增殖和传递应激信号的关键性蛋白激酶，在许多细胞因子的信号传导中起着重要的中介作用。MAPK的主要功能是将炎症刺激信息传递给细胞核，通过激活下游炎症因子介导RA慢性炎症及关节损伤，从而参与其发病机制。与RA病理状态的维持及病情进展密切相关的MAPKs有cjun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶ERK、p38MAPK 3种。其中JNK与基质金属蛋白酶的产生相关，从而调节细胞外基质的降解；p38MAPK通过微调抗炎及促炎信号影响炎性反应。JNK通路是MAPK通路中重要通路之一，广泛参与免疫应答和炎症反应，能调节多种炎症蛋白基因的表达，在炎症反应中起关键作用[16]。实验结果表明，五味甘露药浴散加减方能够明显降低踝关节滑膜JNK1的蛋白表达和膝关节滑膜JNK1基因的表达。五味甘露药浴散加减方可降低TNFα的水平，通过降低对JNK通路的刺激作用，下调MMP3的表达。这些炎症因子促进了类风湿关节炎的发展，五味甘露药浴散加减方通过调控JNK通路、降低TNFα等炎症因子的表达对类风湿关节炎产生治疗作用。此外，ERK通路的活化可促使T细胞增殖过度和多种细胞因子异常分泌增多，研究发现TNFα可通过ERK1/2信号转导通路抑制Ⅱ型胶原和连接蛋白的基因表达，进而干扰关节软骨合成和重建[17]，本实验中，五味甘露药浴散加减方能够降低踝关节滑膜的ERK1/2蛋白表达和膝关节滑膜ERK基因的表达。在RA滑膜组织T细胞和滑膜内皮细胞上能检测到磷酸化p38 MAPK，其能调节编码细胞黏附分子基因表达。本实验中，五味甘露药浴散加减方能够降低踝关节滑膜p38蛋白表达和膝关节滑膜p38基因表达。五味甘露药浴散加减方可降低TNFα的水平，降低RA滑膜细胞中p38显著表达。通过p38 MAPK通路调控，降低滑膜细胞炎性因子的分泌和减弱关节组织的破坏。

综上，MAPK信号通路参与了RA的炎症反应过程，JNK，ERK和p38途径在类风湿关节炎滑膜中活化显著增强。关节局部的炎症及骨质的破坏都与这3条通路的活化增强有关。实验发现，与模型组相比，给药14 d后，五味甘露药浴散加减方高剂量大鼠血清中TNFα的水平降低，给药28 d后，滑膜组织中JNK1，ERK和p38的表达下降。实验结果说明五味甘露药浴散加减方在控制类风湿关节炎的关节炎症状，缓解关节肿胀方面具有明显疗效，揭示其机制可能为通过抑制MAPK信号传导通路，从而减少炎性因子的释放，抑制滑膜异常增殖，达到阻抑类风湿关节炎关节骨质侵蚀的目的。而类风湿性关节炎发病十分复杂，涉及多条炎症通路网络，同时涉及免疫、内分泌等多个系统，因此后续实验应从其他途径探讨五味甘露药浴散加减方治疗类风湿性关节炎的机制，从而为今后的临床工作提供更多科学理论依据。

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[责任编辑 张宁宁]