儿童血流感染苍白杆菌的鉴定和同源性分析*

刘健龙，屈平华，蔡婷婷，莫丽亚，宋春荣，康艳，李先斌(.湖南省儿童医院检验科，长沙 40007；.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广州 50006；.河北大学附属医院检验科，河北保定 07000)

·临床实验研究·

儿童血流感染苍白杆菌的鉴定和同源性分析*

刘健龙1，屈平华2，蔡婷婷3，莫丽亚1，宋春荣1，康艳1，李先斌1
(1.湖南省儿童医院检验科，长沙 410007；2.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广州 510006；3.河北大学附属医院检验科，河北保定 071000)

目的 对儿童血液样本中分离的苍白杆菌进行菌种鉴定和同源性分析。方法 收集经Vitek 2 Compact仪器鉴定的人苍白杆菌26株，用API微生物鉴定药敏分析系统及配套20非肠杆菌科细菌鉴定试条(20 NE)进行再鉴定，并用手工试验进行生化表型鉴定；PCR扩增16S rRNA基因、recA基因并进行测序分析；采用Vitek 2 Compact及配套GN13卡进行药敏试验；采用脉冲场凝胶电泳进行同源性分析。结果 26株经仪器鉴定及手工生化鉴定均为人苍白杆菌。16S rRNA基因和recA基因扩增产物测序分析，25株为解糖假苍白杆菌，1株为假贵格纳苍白杆菌。药敏分析显示以上26株菌株对氨曲南均耐药，对喹诺酮类、氨基糖苷类、复方磺胺甲噁唑、头孢菌素和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率在80%以上。脉冲场凝胶电泳分析显示，该25株解糖精假苍白杆菌为高度同源菌株，仅有1～3条带的差异。结论 结合生化表型、基因扩增和测序分析可以将苍白杆菌鉴定至种。检测菌株中解糖精假苍白杆菌高度同源，可能为一次聚集性感染。

苍白杆菌；血流感染；同源性分析

苍白杆菌(Ochrobactrum)是一种非发酵菌，可引起医疗器械污染和人的感染。随着分子生物技术的应用，人们发现Vitek 2 Compact仪器鉴定的人苍白杆菌包含苍白杆菌属和假苍白杆菌属(Pseudochrobactrum)2个菌属的多个菌种[1-3]。为了明确苍白杆菌的菌种，对我院2013年5至8月26株Vitek 2 Compact仪器法鉴定的人苍白杆菌进行菌种鉴定和同源性分析，发现了一起由解糖精假苍白杆菌(P.saccharolyticum)引起的聚集性感染，报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及患者信息 收集湖南省儿童医院2013年5月至8月血培养标本中分离并经Vitek 2 Compact仪器法鉴定的非重复人苍白杆菌26株。以上菌株分离自26例儿童患者血液样本，年龄1月至8岁，中位年龄2.5岁。具体信息见表1。脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)的标准菌株沙门菌H9812购自广东省临床检验中心。

表1 26株苍白杆菌的菌株来源和相关信息

1.2 主要仪器及试剂 Bactec 9120和Bactec FX全自动血液培养仪及配套儿童培养瓶(BD公司)；Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析系统和配套GN鉴定卡和GN13药敏卡、API微生物鉴定药敏分析系统及配套20非肠杆菌科细菌鉴定试条(20 NE)(法国生物梅里埃公司)；氧化酶试剂及O-F管(杭州微生物试剂公司)；ABI Veriti 96孔热循环仪(美国 ABI 公司)；NanoDrop 2000 C分光光度计(ThermoFisher Scientific公司)；全自动凝胶成像系统(英国Syngene公司)；Taq酶体系、XbaⅠ和SpeⅠ内切酶、DL 2000 DNA marker和细菌基因组DNA提取试剂盒(大连TaKaRa公司)；引物合成及测序由上海英捷维基公司完成；CHEF Mapper XA脉冲场电泳仪(美国Bio-Rad公司)；蛋白酶K(美国Sigma公司)。

1.3 菌种鉴定 采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析系统和配套GN鉴定卡、API微生物鉴定药敏分析系统及配套20NE细菌鉴定试条对收集26株菌株进行生化鉴定，具体操作参见说明书；并结合手工试验进行氧化酶、脲酶、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖同化反应及O-F试验。

1.4 细菌16S rRNA和recA基因PCR扩增及测序 采用试剂盒提取细菌基因组DNA，按照说明书进行。参照文献[1,4]合成16S rRNA和recA基因引物，序列见表2。PCR 扩增体系为50 μL，包括DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各2 μL，dNTP混合液(2.5 mmoL/L)4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 35.75 μL。16S rRNA基因扩增参数如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min；recA基因的扩增参数如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72℃ 7 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，送上海英捷维基公司进行双向测序。16S rRNA基因测序结果采用EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)的参考序列进行比对，recA基因测序结果以BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对。16S rRNA基因序列比对结果的解释参考美国临床和实验室标准化协会(CLSI) MM18-A通用解释标准相关内容[5]，recA基因序列比对结果的解释参考文献[1-3]，并结合生化实验结果及文献[6]进行最终的菌种判定。

表2 基因PCR扩增所用引物序列

1.5 药敏试验 采用Vitek 2 Compact及配套GN13卡对实验菌株进行药敏试验，具体操作参见说明书。参考CLSI M100 S25[7]中非肠杆菌科细菌的药敏标准进行药敏结果判定。

1.6 PFGE分析 取过夜培养菌落，调整吸光度(A)值至3.6～4.5，用10 g/L低熔点胶灌模，蛋白酶K 56 ℃水浴消化12 h，限制性内切酶SepⅠ10 U酶切过夜；CHEF Mapper XA脉冲场电泳仪电泳条件：采用10 g/L胶，0.5×TBE缓冲液，14 ℃，6 v/cm，120 °角，脉冲时间5～35 s，电泳22 h。分子量标记采用经限制性内切酶XbaⅠ处理的标准菌株H9812，其余处理过程同实验菌株。电泳后的凝胶以5 μg/mL溴化乙锭溶液染色，凝胶成像系统拍照，运用BioNumerics software分析软件进行同源性分析。按PFGE相关性的判断标准，PFGE图谱无条带差异为相同菌株，有1～3条带的差异为紧密相关的同一基因型[8]。

2 结果

2.1 菌株生化鉴定结果 26株实验菌株均为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性、O-F试验为产碱型，符合非发酵特征。经Vitek 2 Compact和API 20NE鉴定均提示为人苍白杆菌，但生化反应存在一定差异。其中菌株1～23、25和26经Vitek 2 Compact GN鉴定编码为4000001100401001，API 20NE鉴定编码为0042145；菌株24经Vitek 2 Compact GN鉴定编码为60010111320501001，API 20NE鉴定编码为1243344。

2.2 菌株分子鉴定结果 采用16S rRNA基因通用引物扩增，26株实验菌株均扩增到1 500 bp左右靶基因，其中25株菌与解糖精假苍白杆菌CCUG 33852(登录号：AM180484)的相似度为100%，与不解糖精假苍白杆菌CCUG 33852(登录号：AM180485)的相似度为99.8%，结合葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖同化反应阳性结果，可确认为解糖精假苍白杆菌。以上25株菌均未扩增到recA基因。另1株菌(菌株24)经16S rRNA基因序列分析，与假贵格纳苍白杆菌CCUG 30717(登录号：AM422371)和OchrobactrumthiophenivoransDSM 7216(登录号：AM490617)的相似度均大于99.0%，而该菌株的recA基因序列与假贵格纳苍白杆菌CCUG 30717的相似度为99.5%，与OchrobactrumthiophenivoransDSM 7216(登录号：AM422872)的相似度为87.4%，故结合recA基因序列分析可鉴定为假贵格纳苍白杆菌。

2.3 药敏分析 26株苍白杆菌对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦及复方磺胺甲噁唑均敏感；对头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南和氨曲南的耐药率分别为7.7%、23.1%、23.1%、23.8%和100.0%。

2.4 同源性分析 经限制性内切酶SepⅠ酶切的PFGE同源性分析结果显示，25株解糖精假苍白杆菌可分为3个克隆群，菌株1、2、4、5、6、8、9、11、14、16、17、20、21、22、23、25和26号共17株为同一个克隆，3、7、12、13、15、18和19号共7株为同一个克隆，10号为一个克隆。该3个克隆的PFGE电泳条带非常接近，仅相差1～3个条带，Dice相关系数高达95%～100%。该25株解糖精假苍白杆菌为高度同源的同一克隆下的不同亚型的菌株。而另一株为假贵格纳苍白杆菌，Dice相关系数<65%，为不相关菌株。见图1。

注：1～23、25和26为解糖精假苍白杆菌，24为假贵格纳苍白杆菌。

图1 26株菌的PFGE分析结果

3 讨论

假苍白杆菌属是2006年新建立的一个菌属[3]。目前，该属的解糖精假苍白杆菌和不解糖精假苍白杆菌有临床分离报道[3,9]。由于其菌种资料新，目前在Vitek 2等微生物鉴定分析仪以及质谱鉴定仪的数据库尚无相关资料，故采用上述方法无法得到准确鉴定。本研究采用基因测序和生化表型鉴定方法，鉴定出26株苍白杆菌中有25株为解糖精假苍白杆菌，1株为假贵格纳苍白杆菌；结合PFGE的同源性分析，显示25株解糖精假苍白杆菌为高度同源的同一克隆下的不同亚型的菌株，最终确定了1起解糖精假苍白杆菌引起的聚集性感染。由研究鉴定结果和文献资料[3]来看，苍白杆菌属脲酶阳性，假苍白杆菌属脲酶阴性，可作为重要的鉴别依据。本研究中recA基因是参考苍白杆菌设计，假苍白杆菌属虽然与苍白杆菌属亲缘关系密切，但仍存在较大差异，因此在假苍白杆菌属中未检测到recA基因。

本研究25株假苍白杆菌对氨曲南均表现为耐药，对哌啦西林/他唑巴坦、喹诺酮类药物和复方磺胺甲噁唑均表现为敏感，而对头孢类及亚胺培南有不同的耐药性，这与报道的人苍白杆菌耐药情况基本相同[6-7]。根据药敏结果，假苍白杆菌对喹诺酮类和氨基糖苷类药物均表现为敏感，但儿童不推荐使用；所以，临床在考虑治疗由此类假苍白杆菌引起的儿童血流感染时，可以考虑哌啦西林/他唑巴坦。

在本次聚集性感染中收治的26例苍白杆菌败血症患儿，除去4例门诊患儿，其余全部来自内科病房。采用硅胶材质类的留置针输液及抽血是儿童治疗过程中一个常用手段，本研究中采用留置针抽血的患儿占23.1%。人苍白杆菌导致人体导管相关性感染可能与其能粘附到硅胶上的能力有关，可造成眼内炎、泌尿系感染、脑膜炎、心内膜炎、肝脏和骨盆及胰腺炎等[10]。笔者考虑此次研究的部分内科患儿的由假苍白杆菌引起的血流感染，可能与上述现象有关。

苍白杆菌是儿童尤其是婴幼儿败血症的重要病原菌[11]，甚至出现了产AmpC酶的高度耐药性苍白杆菌[2,6]。尽管一般的观点认为苍白杆菌属的毒力和致病力较弱，但由于该菌与布鲁菌亲缘关系密切，其基因突变可能会出现高致病苍白杆菌分离株[12]。因此，有必要加强对苍白杆菌和相关菌种的监测，预防留置针引起院内感染的发生和暴发流行。

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(本文编辑：周万青，刘群)

Identification and homology analysis ofOchrobactrum-like species infection in bloodstream of children

LIUJian-long1,QUPing-hua2,CAITing-ting3,MOLi-ya1,SONGChun-rong1,KANGYan1,LIXian-bin1
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,Children′sHospitalinHunanProvince,Changsha410007,Hunan; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvinceHospitalofChineseMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou520006,Guangdong; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,Hebei,China)

Objective To identify and analyze the homology ofOchrobactrumisolated from clinical blood samples of children. Methods The 26 strains ofOchrobactrumanthropiwere identified by Vitek 2 Compact and test strips of API 20 NE bacterial identification system. The biochemical phenotypes were identified by manual tests. The 16S rRNA andrecAgene were amplified by PCR and sequenced. The drug sensitivity tests ofOchrobactrumanthropiwere performed by Vitek 2 Compact and matched GN13 card. The homology was analyzed by pulsed field gel electrophoresis. Results Based on the identification of the instruments and the manual tests for biochemical phenotype, all the 26 experimental strains wereOchrobactrumanthropi. The results of sequencing for 16S rRNA andrecAgene amplification products showed 25 strains werePseudochrobactrumsaccharolyticumand the other 1 wasO.grignonensein. Drug sensitivity analysis showed that the all the 26 strains were resistant to aztreonam, but the sensitive rates to quinolones, aminoglycosides, trimethoprim sulfamethoxazole, four generation of cephalosporins and the antibiotics compound of piperacillin/tazobactam were all more than 80%. Pulsed field gel electrophoresis analysis showed that the 25 strains were highly homologous with differences of only 1 to 3 bands in fingerprint profiles. Conclusion Based on the biochemical phenotype and the sequencing of 16S rRNA andrecAgene, theOchrobactrum-like bacteria could be identified to the level of species. The highly homologous strains ofPseudochrobactrumsaccharolyticummay be sourced from a clustered infection.

Ochrobactrum; bloodstream infection; homology analysis

湖南省卫生和计划生育委员会科研项目(C2015-61)。

刘健龙，1978年生，男，副主任技师，研究方向为细菌学分类及耐药机制。

李先斌，副主任技师，大学本科，E-mail:lxb5600983com@sina.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.10

R446.5

A

2017-02-24)