1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

李基棕+李文良+毛立+郝飞+杨蕾蕾+张纹纹+江杰元

摘要：为确定导致绵羊细菌性感染死亡的病原，从送检病死绵羊肺脏中分离纯化出1株细菌，并对其进行培养特性观察、生化反应、PCR鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示，分离纯化的细菌为革兰氏阴性短杆菌，经生化反应和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌；该细菌对庆大霉素、头孢噻肟高度敏感；对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素耐药；将1×109 CFU/mL菌液10倍系列稀释后感染6～8周龄小白鼠，该细菌对小白鼠的半数致死量为1×106.2 CFU/mL；死亡动物的剖检病变与发病绵羊类似，并从病变器官内分离到细菌。本研究为进一步探讨溶血性曼氏杆菌的致病机理奠定了基础。

关键词：绵羊；溶血性曼氏杆菌；分离鉴定；致病性

中图分类号： S855.1+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0156-03

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，Mh）别称溶血性巴氏杆菌，该菌属于机会致病菌，可长期寄生于牛、绵羊、山羊等反刍动物及其他动物上呼吸道[1-2]。当受到外界环境骤变、长途运输等刺激出现应激反应，动物机体抵抗力下降，病菌可趁机侵入从而致病，病毒和支原体感染如绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、副流感病毒等，可使得机体对溶血性曼氏杆菌更易感[3-4]。它能够引起牛、羊肺炎，新生羔羊的急性败血症，给养牛业和养羊业带来较大的经济损失[5]。

2015年底，安徽宣城某养羊场发生疫情，死亡率达10%以上，发病羊主要表现为咳嗽、喘气、流鼻涕等呼吸道症状，剖检病变主要为肺脏出血、充血、水肿、实变。从发病羊肺脏中分离出1株菌株，通过生化鉴定和PCR鉴定，确定该分离株为溶血性曼氏杆菌。

1材料与方法

1.1主要试剂

绵羊鲜血琼脂培养基、微量生化反应管、抗菌药物药敏纸片均购自浙江杭州微生物试剂公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均购自北京全氏金生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2试验动物

6～8周龄BALB/c小鼠，购自扬州大学比较医学中心。

1.3病原的分离

无菌采集绵羊肺脏组织块接种于鲜血琼脂平板上，培养24 h后，挑取单个菌落进行纯化。挑取纯化的菌落涂片进行革兰氏染色镜检。

1.4生化试验

将纯化的菌落按照常规方法接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等生化鉴定管中，置于37 ℃恒温培养箱中培养，观察其生化特性。

1.5PCR鉴定

参照Alexander等基于lkt基因设计的溶血性曼氏杆菌特异性引物（LktF：5′-GCAGGAGGTGATTATTAAAGTGG-3′；LktR：CAGCAGTTATTGTCATACCTGAAC）[4]进行PCR扩增，预期扩增片段大小为206 bp。

以纯培养细菌的染色体DNA为模板，PCR反应体系为25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，无菌水18 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳检测。将目的片段切胶回收，并与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，经鉴定正确后送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。1.6耐药性试验

采用纸片扩散法进行药敏试验，将分离的溶血性曼氏杆菌均匀涂布于鲜血琼脂平板上，然后将药敏纸片紧贴于琼脂表面，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.7小鼠致病性试验

将分离纯化的菌株接种于含犊牛血清的LB液体培养基中，37 ℃培养24 h，取菌液10倍系列稀释，进行活菌平板计数。取小鼠30只，随机分为6组，将计数后的菌液进行腹腔注射，菌液（108、107、106、105、104 CFU/mL）0.2 mL/只，测定其致病性。对照组注射等量的培养基。对死亡小鼠进行剖检，观察组织病变，同时采集肺、脾、肝进行细菌分离培养。

2结果与分析

2.1细菌的分离培养

病原菌在绵羊鲜血琼脂平板上培养24 h后，形成圆形、光滑、湿润、半透明、不溶血的小菌落。革兰氏染色呈短小、多个的阴性菌（图1）。

2.2生化鉴定

该菌可发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，不发酵乳糖、吲哚、甘露糖，符合曼氏杆菌生化特性。

2.3PCR鉴定

将分离的病原菌进行PCR扩增，得到与预期结果相符合的206 bp的特异性核酸片段（图2）。测序结果表明，该分离株与GenBank中登录的AF314503、M24179、M20730、AF314512、AF314520、AF314522、AS314519、AF314518、AY425280、AF314517、AF314521、AF314506同源性较高，均在94%以上。进化树分析发现，该毒株与AF314503、M24179、M20730亲缘关系最近，共同组成1组微小分支（图3）。

2.4药敏试验

对分离到的菌株进行药敏试验，结果表明，该细菌仅对庆大霉素和头孢噻肟高度敏感；对链霉素、阿奇霉素、头孢曲松和氨苄西林中度敏感；对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素不敏感（表1）。

2.5致病性试验

过夜培养的细菌经平板计数，菌液细菌数为1×109 CFU/mL，取菌液10倍系列稀释腹腔接种小鼠，6 h后108 、107 CFU/mL 剂量组均有不同程度的发病，12 h后除105 、104 CFU/mL组外均出现死亡，对照组小鼠未见异常（表2）。因此，该分离菌对6～8周龄BALB/c小鼠的LD50为106.2 CFU/mL。

表2不同稀释度溶血性曼氏杆菌的致病性试验

试验动物不同稀释度的致死数10102103104105LD50

（CFU/mL）试验鼠5/55/53/50/50/5106.2

3讨论

溶血性曼氏杆菌是牛和羊鼻咽部的共生菌，主要引起肺炎、新生羔羊败血症、羊乳腺炎等，也是犊牛“船运热”的主要病原。目前，该病原流行较广，Shanthalingam等从40份发病羊肺脏中分离到8株溶血性曼氏杆菌[6]；冯旭飞等对四川地区临床采集的120份肺组织和鼻拭子进行检测，结果检出率达51.67%[7]；李娟等、徐慧等和李雪霞等分别证实了该病原在江苏、新疆和云南地区的流行[5，9-10]。

本研究从发病羊肺脏中分离并纯化细菌，经菌落形态、生化特征和PCR鉴定，最终确定其为溶血性曼氏杆菌。综合临床症状、染色镜检可以有效缩小病原菌范围，结合PCR和测序鉴定，能够更加准确地确定该病原。致病性结果表明，108、107 CFU/mL剂量组感染小白鼠后，6 h出现不同程度发病症状，表现为精神沉郁、食欲废绝等，12 h相继出现死亡，而对照组未见异常。死亡小鼠的剖检病变为肺脏充血，肝脏和脾脏肿大等，从死亡小鼠脏器中分离出与感染菌株形态特征一致的菌株。

抗生素的使用是养殖户预防和治疗疾病的重要手段，细菌的耐药性是困扰养殖户的一大难题。本研究的试验结果表明，溶血性曼氏杆菌对庆大霉素和头孢噻肟高度敏感；对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素等药物产生了耐药性，与冯旭飞等[6]、Katsuda等[11]和 Lubbers 等[12]报道不尽相同，说明不同地域分离株耐药性存在一定差异。该试验结果也为发病羊群正确合理用药提供参考。

目前，疫苗免疫是控制溶血性曼氏杆菌病的重要措施之一，由于各血清型之间交叉免疫保护性较低，疫苗的免疫谱窄，以至于本病未能得到有效的控制。因此，有待于研发预防溶血性曼氏杆菌病更佳的疫苗[13-14]。

参考文献：

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[3]韩猛立，康立超，钟发刚，等. 细菌性牛呼吸道疾病的研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2013，40（5）：165-172.

[4]Alexander T W，Cook S R，Yanke L J，et al. A multiplex polymerase chain reaction assay for the identification of Mannheimia haemolytica，Mannheimia glucosidal and Mannheimia ruminalis[J]. Veterinary Microbiology，2008，130（1/2）：165-175.

[5]李娟，刘阳，彭欠欠，等. 羊溶血性曼氏杆菌的分离与鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医，2013（20）：96-97.

[6]Shanthalingam S，Goldy A，Bavananthasivam J，et al. PCR assay detects Mannheimia haemolytica in culture-negative pneumonic lung tissues of bighorn sheep（Ovis canadensis） from outbreaks in the western USA，2009-2010[J]. Journal of Wildlife Diseases，2014，50（1）：1-10.

[7]馮旭飞，刀筱芳，王志敏，等. 绵羊肺脏中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其药物敏感性分析[J]. 中国畜牧兽医，2014，41（8）：224-228.

[8]冯旭飞，刀筱芳，李定菲，等. 溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌双重 PCR 检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学，2014，44（6）：624-629.

[9]徐慧，贺云霞，龚玉梅，等. 溶血性曼氏杆菌的分离鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医（科技版），2009（12）：97-98.

[10]李雪霞，李富祥，赵文华，等. 云南羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 上海畜牧兽医通讯，2014（1）：36-38.

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[12]Lubbers B，Hanzlicek G. Antimicrobial multidrug resistance and coresistance patterns of Mannheimia haemolytica isolated from bovine respiratory disease cases—a three-year （2009—2011） retrospective analysis[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2013，25（3）：413-417.

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