肺泡灌洗液RNA恒温扩增实时检测在肺结核诊断中的应用价值

吴 璇，毛晓辉，王 勃，王龙智，薛 瑜

西安市胸科医院内四科(西安710100)

肺泡灌洗液RNA恒温扩增实时检测在肺结核诊断中的应用价值

吴 璇，毛晓辉，王 勃，王龙智，薛 瑜

西安市胸科医院内四科(西安710100)

目的：探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)中结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测(TB-RNA)、TB-PCR及浓缩集菌法在肺结核诊断中的价值。方法：对160例疑似肺结核的初诊住院患者行纤维支气管镜检查，并以肺泡灌洗液送检结核分枝杆菌培养、TB-RNA、TB-PCR及浓缩集菌法找抗酸杆菌，以结核分枝杆菌培养阳性为金标准，计算其他三种检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及一致性。结果：以结核分枝杆菌培养为金标准，浓缩集菌法、TB-PCR、TB-RNA三种检测方法的敏感度分别是67.6%(46/68)、63.2%(43/68)、76.5%(52/68)；特异度分别是97.9%(46/47)、89.4%(42/47)、95.7%(45/47)；阳性预测值分别是97.9%(46/47)、89.6%(43/48)、96.3%(52/54)；阴性预测值分别是67.6%(46/68)、62.7%(42/67)、73.8%(45/67)；ROC曲线下面积分别是0.828、0.763、0.861；Kappa(K)值分别是0.613、0.494、0.690。结论：TB-RNA有较高的敏感度、特异度，与结核分枝杆菌培养结果一致性高，是临床诊断的可靠依据。

肺是结核病最好发的器官，也是传染控制的重点，但是随着临床工作中不典型肺结核越来越多，结核病的诊断难度日益凸显。细菌学检查是诊断结核病的主要依据，但现有的实验室检查手段均存在一定弊端，并不能满足临床需要。痰结核分枝杆菌培养是诊断肺结核的“金标准”，但阳性率偏低，培养周期长。TB-PCR是一种以核酸扩增技术为基础的分子生物学诊断技术，此项技术已在临床得到广泛的应用[1]。但由于其敏感性高，在技术操作中可能因标本污染等因素呈现假阳性。

我们采用纤维支气管镜检查，留取住院患者支气管肺泡灌洗液，进行TB-RNA检测，并以结核分枝杆菌培养阳性为金标准，对TB-RNA检测结果进行评估。

资料与方法

1 一般资料 收集西安市胸科医院2015年4月至2015年6月所有疑似肺结核的初诊住院患者160例，均行纤维支气管镜检查并以肺泡灌洗液送检结核分枝杆菌培养、TB-RNA、TB-PCR及浓缩集菌法找抗酸杆菌，其中确诊肺结核68例，临床诊断肺结核45例，非肺结核患者47例。平均年龄47.3±11.7岁，其中男95例，平均年龄44.2±8.2岁，女65例，平均年龄39.6±5.4岁。全部符合肺结核诊断标准[2]。

2 研究方法

2.1 全麻下纤维支气管镜检查收集肺泡灌洗液： 160例患者均在入院后1周内行纤维支气管镜检查，所有患者均签署纤维支气管镜检查知情同意书。

2.2 检测方法：160份肺泡灌洗液标本分别做结核分枝杆菌培养、TB-RNA检测、TB-PCR检测、浓缩集菌法找抗酸杆菌。结核分枝杆菌培养采用BACTE MGIT960 System快速全自动分枝杆菌培养、药敏检测系统对肺泡灌洗液进行培养，以6～8周为培养周期，结束后读取结果。TB-RNA检测方法采用上海仁度生物科技有限公司生产的结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)对肺泡灌洗液进行检测。要求防污染操作，留取灌洗液后半小时内送检。检测结果以<40为阳性。TB-PCR检测采用奥博生物集团有限公司的晶芯分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对肺泡灌洗液进行检测，用ABI公司的7300Real-Time PCR System荧光PCR检测系统对数据进行读取分析。检测结果以Ct值小于40为阳性。浓缩集菌法找抗酸杆菌检测是对肺泡灌洗液进行抗酸杆菌染色，在显微镜下观察染色结果，以每100个视野抗酸杆菌≥3个为阳性。

2.3 记录160例患者临床资料：临床资料包括姓名、年龄、性别、诊断结果、胸部CT以及肺泡灌洗液的结核分枝杆菌培养、TB-RNA、TB-PCR及浓缩集菌法找抗酸杆菌检测结果，根据肺结核诊断标准将160例患者分为确诊肺结核组、临床诊断肺结核组及非肺结核组。

3 统计学方法 本研究采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计数资料以百分比表示，以受试者工作特征(Receiver operation characteristic， ROC)曲线评价诊断价值。以结核分枝杆菌培养阳性为金标准，计算TB-RNA、TB-PCR及浓缩集菌法找抗酸杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致性等。三个实验的一致性采用一致性检验，用Kappa(K)值表示，K值>0.75表示一致性好；0.4

结 果

1 临床资料 本研究共纳入患者160例，确诊肺结核患者68例，临床诊断肺结核患者45例，非肺结核患者47例，非肺结核组包括肺炎患者23例，支气管扩张患者14例、肺部肿瘤患者10例。因临床诊断肺结核组病例对本研究无意义，故剔除，将其余115例患者数据做统计学分析。

2 确诊肺结核及非肺结核患者检测结果 68例确诊的肺结核患者三种检测方法的结果显示浓缩集菌法找抗酸杆菌阳性47例(69.1%)，TB-PCR阳性42例(61.7%)，TB-RNA阳性53例(78.0%)。47例非肺结核患者三种检测方法的结果显示浓缩集菌法找抗酸杆菌阳性0例(0%)，TB-PCR阳性4例(8.5%)，TB-RNA阳性1例(2.1%)。

3 三种方法结果比较 将确诊肺结核组和非肺结核组归为1组，以结核分枝杆菌培养阳性作为阳性对照，分别对比肺泡灌洗液浓缩集菌法找抗酸杆菌、TB-PCR及TB-RNA的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、ROC曲线下面积及Kappa(K)值，检测结果显示：三种检测方法的敏感度分别是67.6%(46/68),63.2%(43/68),76.5%(52/68)；特异度分别是97.9%(46/47),89.4%(42/47),95.7%(45/47)；阳性预测值分别是97.9%(46/47),89.6%(43/48),96.3%(52/54)；阴性预测值分别是67.6%(46/68),62.7%(42/67),73.8%(45/67)；ROC曲线下面积分别是0.828,0.763,0.861；Kappa(K)值分别是0.613，0.494,0.690。研究表明三种检测方法中TB-RNA敏感度较好，阴性预测值最高，ROC曲线下面积最大，与痰结核分枝杆菌培养阳性结果的一致性最高(见表1)。

表1 浓缩集菌抗酸杆菌、TB-PCR、TB-RNA与痰培养结果对比

注：敏感度=真阳性例数/(真阻性例数+假阴性例数)；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)

讨 论

RNA恒温扩增实时检测技术原理是通过设计特异性的Mtb核糖体RNA扩增引物及优化探针(Optimalprobe,patent pending)技术，使用M-MLV反转录酶及极高转录活性的T7RNA多聚酶来同时实现核酸恒温扩增和仪器实时荧光检测，能够快速、直观地反映样本中Mtb的感染情况。其优点是除了可以检测是否存在结核分枝杆菌，还可以检测是活菌还是死菌。因为结核分枝杆菌死亡后RNA降解，而DNA不降解，所以RNA阳性意味着检出了活菌。另外，TB-RNA检测技术还可以作为结核病是否活动及用药后疗效的检测[3]。

本研究结果显示TB-RNA检测具有较高的敏感度(76.5%)、特异度(95.7%)、阳性预测值(96.3%)和阴性预测值(73.8%)，由此可见三种检测方法中TB-RNA敏感度较好，阴性预测值最高，ROC曲线下面积最大，与痰结核分枝杆菌培养阳性结果的一致性最高。此项研究结果与范琳等[4]的研究结果敏感度(81.8%)、特异度(96.9%)、阳性预测值(95.9%)和阴性预测值(84.9%)相似。与崔振玲等[5]在痰标本中TB-RNA研究中的结果相似，但与960培养的一致性低于其结果(88%)。张娟、蔡杏珊等[6-7]的研究得出痰标本TB-RNA检测时间短，敏感度高，特异度和阳性率都较好，且可以区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的结论，与结核分枝杆菌培养的结果有较好的一致性。

从我们的研究发现：支气管肺泡灌洗液的TB-RNA检测技术敏感度及特异度高，可以直接检测到标本中的活菌，而结核分枝杆菌DNA片段存在于活和死亡的细菌中，所以TB-PCR检测假阳性较多，对比体现了TB-RNA检测的准确性和可靠性。另外，TB-RNA检测技术从标本留取到检测结果读出仅2h,较960培养速度快，且得到了与培养69%的符合率。本研究也发现：68例培养阳性的确诊肺结核患者中，支气管肺泡灌洗液的TB-RNA检测有53例阳性，检出率为78%，15例未检出，说明出现了假阴性结果。且非肺结核患者组中出现1例假阳性。原因分析如下：①支气管肺泡灌洗液标本放置时间过长，导致RNA降解，影响阳性检出率；②病灶定位的准确性欠佳，影响灌洗液里细菌的数目。

支气管肺泡灌洗液TB-RNA检测是对于纤维支气管镜下留取的灌洗液进行结核分枝杆菌的定性检测手段，但是纤维支气管镜检查为一项介入检查，存在一定程度风险，尤其对于合并症较多的老年患者及幼儿存在争议，受到禁忌症的限制，因此检查前需严格筛选，评估患者情况，以保证安全性。本研究结果显示与其余两种方法对比，TB-RNA有较高的敏感度，与培养结果有较好的一致性。同时，操作步骤和条件简单，能明显缩短检测周期[8]，可以作为早期临床诊断可靠方法，为及时治疗提供依据。

[1] 张祖平，李小月，李宗光，等．荧光定量PCR 和抗酸染色在联合诊断结核病及其疗效考核中的应用[J]．安徽医学，2010,31(11):1353-1355 ．

[2] 中华人民共和国卫生部疾病预防控制局，中华人民共和国卫生部医政司，中国疾病预防控制中心．中国结核病防治规划实施工作指南(2008年版)[M]．北京：中国协和医科大学出版社，2009：25-27．

[3] Pojllock N ,Westerling J, Sloutsky A. Specimen solution increases the diagnostic utility of the gen-probe mycobacterium tuberculosis direct test[J]. Am JClin Pathol,2006,126:142-147.

[4] 范 琳，王 鹏，杨 妍，等.RNA恒温扩增实时荧光检测技术检测支气管肺泡灌洗液对涂阴肺结核的快速诊断价值[J].中国防痨杂志，2015,37(2):140-144.

[5] 崔振玲，沙 巍，黄晓辰，等.RNA恒温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的研究[J].中华结核与呼吸杂志，2011,34(12)：894-897.

[6] 张 娟，孙炳奇，王 悦，等.RNA恒温扩增实时检测技术在肺结核诊断中的价值[J].实用医学杂志，2013,29(17)：2893-2895.

[7] 蔡杏珊，马品云，张院良，等.实时荧光核酸恒温扩增检测技术在结核诊断中的临床应用[J].中国防痨杂志，2014,36(6)：458-461.

[8] 罗 贤，张腊红，洪理泉，等.恒温扩增实时荧光检测技术在肺结核患者诊断中的应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，2015,29(2)：183-185.

(收稿：2016-08-10)

肺结核/诊断 支气管肺泡灌洗液 细胞培养 @TB-RNA

R521

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.05.024