鸡传染性支气管炎病毒M基因真核表达载体的构建及免疫效力研究

孙晓云，刘成倩，易建中，李 红

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106）

鸡传染性支气管炎病毒M基因真核表达载体的构建及免疫效力研究

孙晓云1，2，刘成倩2，易建中2，李 红2

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106）

从GenBank上下载鸡传染性支气管炎病毒（IBV）H120型标准株M基因的标准序列，以此标准序列为模板设计合成一对引物。从IBV尿囊液中提取总RNA，采用PCR技术扩增出M基因，将扩增出的目的片段克隆至pMD18-T载体上获得pMD18-IBV-M质粒，通过亚克隆将目的基因连接到经过改造的pEGFP-C1-SCP-SEC载体上，成功构建真核表达质粒pC1-IBV-M。通过间接免疫荧光试验验证了构建的真核载体能在真核细胞内表达，通过动物免疫试验来检测该真核表达载体对动物的免疫保护情况。

鸡传染性支气管炎病毒；M基因；动物试验

鸡传染性支气管炎（Chicken infectious bronchitis，IB）是一种急性呼吸道传染病，通过接触传播，该病由鸡传染性支气管炎病毒（Chicken infectious bronchitis virus，IBV）引起，属于冠状病毒科冠状病毒属。病鸡感染后主要表现为咳嗽、打喷嚏和气管啰音，雏鸡感染后出现伸颈，张口呼吸，流鼻涕，产蛋鸡则表现产蛋减少、产粗壳蛋或软壳蛋。肾型没有呼吸道症状，主要表现肾炎综合征、花斑肾和组织器官表面白色尿酸盐沉积［1-2］。该病对各日龄鸡均具有感染性，其中以1—4周龄的雏鸡最易感，死亡率高达40%—90%［2-4］。该病在世界范围内广泛流行，对养禽业的危害非常大，是重大传染病之一［2］。

IBV为单股正链RNA，有囊膜、不分节段，是目前所知的最大的RNA病毒，病毒粒子略呈球形，有时呈多形性［2］，主要由囊膜和核衣壳两部分组成，囊膜内主要包含膜蛋白（M蛋白）和纤突蛋白（S蛋白）这两种结构蛋白；核衣壳较长呈螺旋状，主要包含核衣壳蛋白（N蛋白）［4-7］。在IBV病毒编码的三种结构蛋白中，M蛋白约占病毒结构蛋白总量的40%，其基因在进化中很少发生变异，具有较高的保守性，各毒株彼此间的核苷酸同源率在85.7%—100%，并且M蛋白与病毒的复制有关，是重要的免疫原基因［9］。

本研究根据鸡传染性支气管炎病毒H120型基因序列设计引物，扩增出M基因，并克隆至真核表达载体pEGFP-C1-SCP-SEC上，以PEI 25000包裹质粒，完成核酸疫苗的制备，通过间接免疫荧光试验验证了其能在真核细胞内表达，通过动物免疫及攻毒试验分析其免疫保护效果，对研制IBV核酸疫苗打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

感受态细胞DH5α、改造好的真核表达载体pEGFP-C1-SCP-SEC均为上海市农业科学院畜牧兽医研究所禽病防控研究室保存，改造好的质粒切去了EGFP基因，加入了SCP启动子和SEC序列；鸡传染性支气管炎H120株活疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司；限制性内切酶Eco RI、Sal I、T4 DNA连接酶均购自Thermo Fisher Scientific公司；pMD18-T载体、rTaq酶、KOD酶购自宝生物工程有限公司；Trizol试剂购自上海生工生物公司；PEI 25000购自阿拉丁试剂有限公司。

1.2 病毒培养

将H120株弱毒活疫苗经PBS溶解，经尿囊腔接种8枚10—11日龄非免疫鸡胚，每枚鸡胚接种200μL，取2枚正常鸡胚作对照，注入等量PBS，用石蜡封孔。弃去接毒后24 h内死亡的鸡胚；孵育72 h后将鸡胚放入4℃冰箱过夜，无菌收集尿囊液，尿囊液应为澄清颜色，黄色或红色则不可用。

1.3 引物设计及IBV总RNA的提取

通过分析GenBank上已登录的IBV-H120株M基因序列，利用软件Primer Premier 5.0设计1对引物，在引物的上下游分别加入Eco RI、Sal I两个酶切位点，引物由上海捷瑞生物公司合成。

斜体为引入的Eco RI和Sal I酶切位点，扩增片段为678 bp。参考Trizol试剂说明书用Trizol裂解法提取IBV尿囊液总RNA。

1.4 RT-PCR反应

反转录体系：取1.3提取的病毒RNA 4μL，加入dNTP 0.5μL，下游引物0.5μL（10μmol/L），在冰上混合后65℃水浴5min，取出立即放冰上2min；依次加入5×PrimeScriptReverse transcriptase Buffer2μL，RNase抑制剂0.5μL，PrimeScript Reverse Transcriptase（5 U/μL）1μL，DEPC水1.5μL，在冰上混合，42℃水浴1 h，然后70℃灭活15 min。

PCR反应体系：取cDNA 4μL，依次加入10×KOD Buffer 5μL，dNTP（2 mmol/L）5μL，MgSO44μL，上/下游引物（10μmol/L）各1.5μL，KOD-Plus酶2μL，ddH2O 27μL以补足50μL体系；PCR反应条件：94℃4 min；（94℃45 s；56℃45 s；68℃1 min）设35个循环；68℃10 min。

取5μL PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳检验是否扩增出目的片段。

1.5 PCR产物的克隆与序列测定

将检验正确的PCR产物用胶回收试剂盒进行回收，连接pMD18-T载体，转化感受态细胞DH5α，在LBAmp＋板上涂布，37℃培养16 h后PCR筛选，筛选出阳性克隆后进行质粒双酶切鉴定。鉴定阳性克隆命名为pMD18-IBV-M，送上海铂尚生物公司测序。

1.6 pC1-IBV-M基因真核表达载体的构建与鉴定

用内切酶EcoR I、Sal I对pMD18-IBV-M质粒和pEGFP-C1-SCP-SEC载体双酶切，回收目的片段，取回收产物16℃连接过夜。产物转化感受态细胞DH5α，涂布LB Kan＋平板，37℃16 h后进行PCR筛选，筛选结果正确的进行大量培养后提取质粒并进行Eco RI、Sal I双酶切，鉴定正确的质粒命名为pC1-IBV-M，送上海铂尚生物公司测序。

1.7 pC1-IBV-M重组质粒的间接免疫荧光试验

按照脂质体2000转染说明书分别用不含血清的DMEM稀释转染试剂脂质体2000和C1-IBV-M，质粒用量为0.8μg/孔，转染试剂的量约为质粒的2—2.5倍，稀释后迅速混匀，室温放置20 min，转入Vero细胞中，同时设立不转染的正常Vero细胞为阴性对照，6 h后换液，放入37℃5%CO2培养箱中培养48 h，将细胞培养液弃掉，加入预冷的75%乙醇，4℃冰箱预冷1 h，弃掉乙醇溶液，用PBS洗3次并风干，使有机溶剂挥发完全，每孔加入1∶50倍稀释的IBV阳性血清200μL，37℃孵育1 h，用PBS洗涤3次，每孔加入1∶200倍稀释的FITC标记兔抗鸡IgG 400μL，37℃避光孵育1 h，用PBS洗3遍并风干，然后在荧光显微镜下观察结果，并拍照。

1.8 H120株M基因真核表达载体的免疫保护性试验

将大量提取的质粒与PEI 25000（1 mg/mL）按N/P＝8混合，轻微震荡后离心混匀，室温放置20 min直接腿部多点肌肉注射。

将7日龄雏鸡随机分为2组，每组5只，试验组注射制备的真核表达载体100μg/只，另一组设为对照，注射PBS 500μL/只。一免1周后同剂量加强免疫1次，二免14 d后攻毒（200μL/只），连续观察14 d后全部扑杀，取肾脏组织提取RNA进行病毒的检测，以评判该核酸疫苗是否具有免疫保护性。

2 结果与分析

2.1 IBV-M基因的RT-PCR扩增

以提取的IBV尿囊液总RNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段全长约678 bp（图1）。

2.2 pMD18-IBV-M基因克隆筛选与酶切鉴定

以pMD18-IBV-M进行菌落PCR筛选，可检测到约678 bp的基因片段（图2）。

将pMD18-IBV-M质粒进行双酶切，得到约2 692 bp和678 bp长度的2个片段，分别与pMD18-T载体和IBV-M基因片段一致（图3）。比对测序结果，IBV-M基因大小正确。

图1 IBV-M基因的PCR扩增Fig.1 PCR product of IBV-M

图2 pMD18-IBV-M筛选阳性克隆Fig.2 PCR of bacterium drop of pMD18-IBV-M

2.3 真核表达载体构建和筛选

将C1-IBV-M重组质粒进行双酶切，得到约4 731 bp和678 bp的2个片段，分别与C1-SCP-SEC载体和IBV-M基因片段一致（图4）。比对测序结果，IBV-M基因大小正确，说明真核表达质粒pC1-IBV-M构建成功。

图3 pMD18-IBV-M酶切鉴定Fig.3 Identification of the p lasm id pMD18-IBV-M

图4 C1-SCP-SEC-IBV-M酶切鉴定Fig.4 Dentification of the recom binant p lasm id C1-SCP-SEC-IBV-M

2.4 重组质粒的间接免疫荧光试验

重组质粒转染Vero细胞后，经过48 h的培养进行免疫荧光试验，通过荧光显微镜观察试验结果，根据是否有荧光来判断免疫荧光的效果，在重组质粒的细胞孔内可以观察到特定的绿色荧光，而阴性对照细胞内无绿色荧光（图5），由观察可知，构建的重组质粒pC1-IBV-M在Vero细胞中能够表达，表达的蛋白能与IBV血清发生特异性结合。

图5 重组质粒的免疫荧光试验（40×）Fig.5 Immunofluorescence assay of recombinant p lasm id（40×）

2.5 C1-IBV-M重组质粒的免疫保护性

两组动物攻毒后连续观察14 d后全部扑杀，取肾脏组织提取RNA，进行病毒PCR鉴定。图中泳道1—5为对照组均能检测到病毒条带，泳道6—10为疫苗组均未检测到病毒。说明本研究制备的真核表达载体具备一定的免疫保护效果（图6）。

图6 动物试验肾脏组织RT-PCR鉴定Fig.6 Identification of kidney RT-PCR

3 讨论

IBV在世界范围内广泛流行，是高度接触性呼吸道传染病，主要侵害鸡的呼吸系统，泌尿生殖系统和消化系统［6］。自从IBV被发现以来，人们就一直致力于IBV的防控，接种疫苗是预防控制IBV传播的最有效手段［13］，普通疫苗的制备成本高，运输和贮存条件要求较高，加上该病原不断出现新的血清型，常导致免疫不成功，这使得普通疫苗在实践应用中从根本上控制不了IB的流行，因此研制高效安全的IB疫苗，对防控和治疗IB具有重大意义［14-18］。随着分子生物学的飞速发展，人们对病毒基因组的结构及其主要免疫功能有了越来越深入的了解，开发研制IB基因工程疫苗，克服传统疫苗的不足之处，已成为未来IB疫苗研制越来越热门的方向［20-21］。

DNA疫苗是指将具有保护性免疫应答的目的基因克隆至真核质粒载体，然后将重组质粒导入机体，它会通过宿主体内的转录系统表达目的抗原，从而刺激机体产生保护性免疫应答的一种生物制剂［21］。其中目的基因的选择至关重要，通常选择该病原主要的保护性抗原基因，一般选择对大多数毒株都有保护作用的抗原基因，其表达产物能诱导机体产生保护性的免疫反应。

有研究表明，M基因保守性高于S1基因而低于N基因［9］，将国内外参考毒株相比较发现彼此之间核苷酸同源率很高，为85%—100%。本研究将扩增的IBV-M基因与GenBank上登录的参考株相比，发现同源率在94%—100%，说明M基因变异性小，这与文献报道一致［23-25］。另有研究表明，M基因能刺激机体产生抗体，在M基因的N端能形成抗原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应［24］。

本试验选择IBV H120株的M基因作为真核表达载体的免疫原基因，将M基因插入改造好的真核表达载体pEFGP-C1-SCP-SEC载体上，通过酶切鉴定和比对测序结果，成功构建IBV-M的真核表达载体，通过动物试验验证了其具有一定的免疫保护性：图6中泳道1—5为对照组均能检测到病毒条带，但是存在非特异性条带，分析原因认为，此非特异性扩增条带为引物自聚体，不影响试验结果。此结果表明了M基因能刺激机体产生特异性抗体，可以保护机体免受病毒的攻击，这与其他研究结果基本一致，为进一步研究IBV的DNA疫苗奠定了基础。

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（责任编辑：张睿）

Construction of DNA vaccine bearing M gene of chicken infectious bronchitis virus and evolution of its immune efficacy

SUN Xiao-yun1，2，LIU Cheng-qian2，YIJian-zhong2，LIHong2
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China；2Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China）

According to the M gene sequence of chicken infectious bronchitis H120，the primers were designed and synthesized.The total RNA was acquired from allantois fluid，M gene was amplified by using PCR technology.The plasmid of pMD18-IBV-M was cloned and then the M gene was inserted into pEGFP-C1-SCP-SEC vector which has been modified to construct the eukaryotic expression vector pC1-IBV-M.The animal’s immune protection was detected by indirect immunofluorscence（IFA）and animal experiment.

Chicken Infectious Bronchitis virus；M gene；Animal experiment

S831.7；S851.3

：A

1000-3924（2017）02-104-05

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.19

2016-05-25

上海市科技人才计划（14YF1414600）；上海市农业科学院中青年科技人员“助跑”计划

孙晓云（1989—），女，硕士，主要从事动物疾病的分子生物学及免疫学研究。E-mail：sunyun0529＠163.com

，E-mail：lihong20061029＠163.com