色素上皮源性因子通过血管内皮生长因子抑制非小细胞肺癌的发生发展

周立霞，吴月明，李娜

（锦州医科大学附属第三医院肿瘤科，辽宁锦州121000）

色素上皮源性因子通过血管内皮生长因子抑制非小细胞肺癌的发生发展

周立霞，吴月明，李娜

（锦州医科大学附属第三医院肿瘤科，辽宁锦州121000）

目的检测A549中色素上皮源性因子（PEDF）通过血管内皮生长因子（VEGF）影响细胞的增殖与迁移的方式。方法过表达或沉默PEDF后观察其对VEGF的影响。MTT与trasnwell检测PEDF对细胞增殖和迁移的作用。实时PCR及Western blotting检测PEDF如何调节VEGF/SRC/FAK通路。结果PEDF可抑制VEGF，进而抑制A549细胞的增殖与迁移。结论PEDF可能成为肺癌的潜在诊疗靶点。

非小细胞肺癌；血管内皮生长因子；A549；色素上皮源性因子

肺癌被认为是目前全世界对人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤［1］。色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是一种分泌型糖蛋白，在多种肿瘤中都存在表达下调的现象，主要功能为促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖、侵袭转移和新生血管生成等［2-3］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是具有旁分泌功能的生长因子，与实体肿瘤生长关系密切［4-6］。

本研究探讨了PEDF通过影响VEGF与其下游SRC/FAK通路调控A549细胞增殖与迁移的方式，以期待由此能找到诊疗非小细胞肺癌的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌A549细胞株（实验室冻存），DMEM培养基（Hyclone公司，美国），胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），trizol、氯仿、异丙醇（上海生工生物工程股份有限公司）。抗体：PEDF，VEGF，SRC，SRCp-Tyr418，FAK，FAKp-Tyr397，cyclin D1，caspase 3，paxillin和GAPDH（Santa公司，美国），SYBR Green（Promega公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养A549细胞至对数生长期。

1.2.2 MTT实验：分别将PEDF质粒或PEDF silence小链（吉凯，上海）转染到处于对数生长期的A549细胞中，培养24 h后，分别于0 h，12 h，24 h，36 h和48 h使用MTT方法测量细胞增殖情况，在490 nm处记录吸光值。

1.2.3 Western blotting：RIPA裂解液裂解组织或转染不同质粒或小链24 h的细胞后，取等量蛋白上样，通过SDS-PAGE电泳（80～120 V）、转膜（100 V，1 h）、封闭后（5%奶粉，1 h），一抗4℃过夜，二抗室温1 h。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据比较使用非配对t检验分析，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549细胞系中PEDF调节VEGF的表达及其下游通路蛋白的表达

A549细胞系中PEDF负向调节VEGF及其下游SRC/FAK通路的磷酸化水平。当在A549细胞系中过表达PEDF时，VEGF的表达以及其下游SRC/FAK通路蛋白的磷酸化水平受到一定程度的抑制，在A549细胞系中沉默PEDF时，VEGF的表达以及其下游SRC/FAK通路蛋白的磷酸化水平得到一定程度的促进。见图1。

图1 PEDF调节VEGF的表达及其下游通路蛋白的表达Fig.1PEDF regulates the expression of VEGF and downstream pathway proteins

2.2 PEDF影响肺癌细胞的增殖

PEDF过表达抑制肺癌细胞A549的增殖，PEDF受到抑制后可以促进肺癌细胞A549的增殖。见图2。

2.3 PEDF调节增殖和凋亡相关蛋白

图2 PEDF抑制A549的增殖（n=3）Fig.2Inhibition of A549 proliferation by PEDF（n=3）

图3 PEDF调节蛋白情况Fig.3PEDF regulation of proteins

PEDF过表达后可以抑制cyclin D1的表达，同时促进caspase 3的表达。反之亦然。见图3。

2.4 PEDF影响肺癌细胞的迁移

PEDF过表达抑制肺癌细胞A549的迁移，PEDF受到抑制后可以促进肺癌细胞A549的迁移。见图4、5。

2.5 PEDF抑制paxillin

PEDF过表达后可以抑制paxillin的表达，反之亦然。见图6。

图4 PEDF过表达后可以抑制A549细胞的迁移×200Fig.4Overexpression of PEDF leads to inhibition of migration of A549 cells×200

图5 PEDF抑制后可以促进A549细胞的迁移×200Fig.5Silencing of PEDF expression promotes the migration of A549 cells×200

图6 PEDF影响paxillin蛋白Fig.6Effect of PEDF on paxillin

3 讨论

目前，肺癌是危害人们生命健康的最严重的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率一直居恶性肿瘤发病率的首席。目前的研究［6-7］表明，肺癌的死亡率约占成人恶性肿瘤死亡数的25%以上。

PEDF具有很强的抗肿瘤作用，其作用机制主要表现为促进肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤新生血管生成等。PEDF在多种肿瘤中被报道具有低表达的现象，但是在非小细胞肺癌中PEDF的研究较少。VEGF除了调节血管生成也可以调节下游的SRC/FAK通路，VEGF通过调节SRC的磷酸化来激活下游通路，进而调节下游一系列功能蛋白，起到促进细胞生长、促进细胞侵袭转移等多种生物学功能，这一系列生物学功能都对肿瘤的发生发展起到促进作用［8］。PEDF可以对VEGF有很强的抑制作用，在机体发生恶性肿瘤时这两种因子之间的平衡可能会向着有利于血管形成的方向发展［9-10］。PEDF在影响VEGF来抑制血管生成之余，是否可以通过抑制VEGF来抑制其下游通路进而影响肿瘤细胞的一系列生物学功能，成为研究的重点。

本研究通过在非小细胞肺癌细胞系A549中过表达或沉默PEDF，检测了VEGF及其下游SRC/FAK通路蛋白磷酸化水平的变化，发现PEDF可以通过抑制VEGF的表达来抑制SRC与FAK的磷酸化水平，也就是说PEDF可以抑制VEGF/SRC/FAK通路的活性。接下来通过MTT实验证实了在A549细胞中PEDF具有抑制细胞生长的作用，PEDF对细胞生长的抑制作用是通过抑制VEGF/SRC/FAK通路下游增殖相关蛋白cyclin D1与促进VEGF/SRC/FAK通路下游凋亡相关蛋白caspase3的表达来实现的。Transwell实验也显示PEDF可以对A549细胞的迁移功能具备一定的抑制作用，这一抑制作用是通过抑制VEGF/SRC/FAK通路下游paxillin蛋白的表达来实现的。

综上所述，本研究首次证实了PEDF在非小细胞肺癌组织中可以通过抑制VEGF的表达来抑制VEGF/SRC/FAK通路进而影响肺癌细胞的生物学功能。可能为非小细胞肺癌的治疗提供新的理论依据。

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（编辑 于溪）

PEDF Inhibits Non-small Cell Lung Cancer Proliferation by Down-regulating VEGF Expression

ZHOU Lixia，WU Yueming，LI Na
（Department of Oncology，The Third Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo analyze the mechanism of pigment epithelium-derived factor（PEDF）regulation in lung cancer cell proliferation and migration by vascular endothelial growth factor（VEGF）.MethodsVEGF expression was observed after overexpression or silencing of PEDF. Proliferation and migration were analyzed by MTT and transwell assays.Real-time PCR and Western blotting were performed to investigate the mechanism underlying PEDF regulation of the VEGF/SRC/FAK pathways.ResultsPEDF could inhibit the proliferation and migration of A549 cells by VEGF.ConclusionPEDF can be considered as a potential therapeutic target for lung cancer.

non-small lung cancer；VEGF；A549；PEDF

R734.2

A

0258-4646（2017）05-0422-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.010

辽宁省自然科学基金（2015020366）

周立霞（1981-），女，主治医师，博士研究生.通信作者：吴明月，E-mail：ymwu67@sina.com

2016-07-06

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