黔西南地区超广普β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌耐药研究

2017-05-18王兴林文德学

临床医药文献杂志(电子版) 2017年13期

关键词：广谱内酰胺酶克雷伯

王兴林，李莹，文德学

（贵州省黔西南州人民医院检验科，贵州黔西南 562400）

・临床交流・

黔西南地区超广普β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌耐药研究

王兴林，李莹，文德学

（贵州省黔西南州人民医院检验科，贵州黔西南 562400）

目的研究本院肺炎克雷伯菌产超广普β-内酰胺酶（ESBLs）的流行情况及其基因类型和耐药情况，为临床上治疗肺炎克雷伯菌相关疾病提供合理用药方案。方法随机选取本院200株肺炎克雷伯菌，采用双纸片确证法确定产超广普β-内酰胺酶的流行情况，通过PCR基因扩增技术确定ESBLs的基因类型，通过自动微生物鉴定系统药敏实验观察ESBLs的耐药性。结果① 本院ESBLs的检出率为32．5%，在200株中65株被检出；②65株ESBLs中，37例（56．9%）为CTX-M基因型，6株（9．2%）为SHV基因型，7株（10．8%）为TEM型，两种基因型9株（13．8%），三种基因型共6株（9．2%）；③产超广谱β-内酰胺酶组和非产超广谱β-内酰胺酶组中，耐药性分布是不同的，产超广谱β-内酰胺酶组对头孢唑林和头孢噻肟的耐药率为100%，而对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛配能的耐药率最低。结论本院以CTX-M基因型ESBLs为主，此外也可以看到SHV基因型和TEM基因型，通过本研究ESBLs基因型的检测，可以更好的指导临床上治疗肺炎克雷伯菌的抗菌素的使用。

肺炎克雷伯菌，β-内酰胺酶，基因，耐药

肺炎克雷伯菌在临床上属于常见的菌属，产β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要原因之一[1]，此外第三代头孢类药物在临床上的广泛使用，细菌逐渐能产生能水解第三代头孢类药物的超广谱β-内酰胺酶。目前对于产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌的临床报告越来越多。因为在国内外均有由产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌引发的全院内的爆发性感染[2]。因此此类菌种也被视为医院内重点监控菌种，此类菌种在临床上往往表现为多药耐药性，为了能有效的控制此类菌种在当地的传播，更加准确的指导临床上抗菌药的使用，准确检验此类菌种是十分必要的，本院是黔西南地区的三级医院，收入的患者来至黔西南地区不同区域，从而可以间接的反应黔西南地区的肺炎克雷伯菌的基因及耐药情况。对我院2013年1月到2014年5月我院分离出的200株肺炎克雷伯菌进行超广谱β-内酰胺酶进行检验，并且对肺炎克雷伯菌的基因型进行分析。

1 研究样本及方法

1.1 研究样本

本研究所有的分离200株肺炎克雷伯菌均来自本院2013年1月到2014年5月我院住院部的患者。

1.2 超广谱β-内酰胺酶的检验

本研究采用的是双纸片确证法，所用试剂如表一。对两个纸片在加了克拉维酸后，测量抑菌环的直径，如果直径大于5cm,便视为产超广谱β-内酰胺酶。

表1 标准纸片确证法药敏纸片

1.4 超广谱β-内酰胺酶基因检验

采用平板划分离分经标准纸片确证法检验为超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的所有菌种，然后进行培养，温度设定为35度，培养时间为16～20 h。将细菌加入100 uL的TE缓冲液中，在100℃下进行细菌裂解，裂解时间为10 min。在经20000rpm离心5分钟后，去上清液5 mL作为本研究的模版。100 mL反应体系中，含有dNTP200nM,模版5 mL，Taq聚合酶1U，Mg1.5nM。反应条件为：预变性温度设置为94摄氏度，反应时间为1分钟，变性温度设定为94℃，时间为1 min。退火45秒。25个循环，在72℃下延伸5 min。最后采用1%的琼脂糖凝胶电泳，并且在紫外灯下观察研究的结果。

表2 引物序列及退火温度

1.5 肺炎克雷伯菌药敏试验

本研究使用美国BD Phoenix100全自动微生物鉴定及药敏分析仪，其配套阴性药敏分析板条含氨苄西林、阿米卡星、氯素霉、环丙沙星、头孢唑林、庆大霉素、左旋氧氟沙星、哌拉西林、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拦维酸、氨曲南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、美洛配能、氨苄西林/舒巴坦、四环素，头孢哌酮/舒巴坦采用纸片法。药敏实验使用肺炎克雷伯菌ATCC10031作为质量控制菌株。

1.6 统计学方法

采用卡方检验比较产超广谱β-内酰胺酶组和非产超广谱β-内酰胺酶组耐药性分布的情况。效验值取0.05。

2 结果

2.1 超广谱β-内酰胺酶的检验结果

200株肺炎克雷伯菌中检出超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌65株（32.5%），产超广谱β-内酰胺酶菌种中，对头孢他啶耐药的有54株（83.1%）,对头孢噻肟/头孢他啶耐药15株（23.1%）。非产超广谱β-内酰胺酶菌种中，对头孢他啶耐药的有6株（13.3%）,对头孢噻肟/头孢他啶耐药7株（15.6%）。

2.2 基因型检验结果

本研究用5中基因引物65株超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌进行基因检验，结果显示有37例（56.9%）为CTX-M基因型，6株（9.2%）为SHV基因型，7株（10.8%）为TEM型，两种基因型9株（13.8%），三种基因型共6株（9.2%）。在本研究中，未见PER，VEB基因型。详见表三、图1到3。

表3 65株超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌基因型分布

2.3 药敏试验结果

200株肺炎克雷伯菌对肺炎克雷伯菌的耐药情况如表四。应用卡方检验比较产和非产超广谱β-内酰胺酶耐药情况显示，两组间的在耐药率上的分布是不一致的，有显著性差异（x2=41.473，P＜0.05），其中产超广谱β-内酰胺酶组对头孢唑林和头孢噻肟的耐药率为100%，而对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛配能的耐药率最低，产超广谱β-内酰胺酶组内可见三种基因型对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛配能不产生耐药性，但检出CTX-M+TEM+SHV的菌种对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛配能有耐药性，分别为37.5%、25%、25%。同时两种基因型对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛配能也均产生耐药性。

3 讨论

肺炎克雷伯菌从细胞壁结构上划分为革兰阴性杆菌，按照异化作用进行区分为兼性厌氧型。肺炎克雷伯菌因为毒力强，致死率高等特点，一直以来都是临床上重点观察的病原菌之一[3]。由于第三代头孢类药物的不合理使用，使得产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌的检出率在逐年的增高，ESBLs能通过质粒介导能水解第三代头孢类药物药物，但是这样的质粒介导可通过克拉维酸进行抑制[4]。本研究纳入的黔西南地区200株菌种中ESBLs的检出率为32.5%，与贵州省ESBLs的检出率相近，贵州省的为30.26%[5]，同时在全国范围内比较，本院ESBLs的检出率高于全国的ESBLs的检出率28.1%[6]。

图1 肺炎克雷伯菌SHV基因扩增产物电泳图

图2 肺炎克雷伯菌TEM基因扩增产物电泳图

图3 肺炎克雷伯菌CTX-M基因扩增产物电泳图

基因型分析

本研究结果显示，基因结果显示在本地区以CTX-M基因型为主，检出率为83.5%，其中单纯CTX-M基因型56.9%，CTX-M+SHV和有CTX-M+TEM总计13.3%，CTXM+TEM+SHV为9.2%。研究显示，CTX-M型是非TEM和SHV型，其来源上并非遗传，可能是通过一些肠杆菌科细菌染色体上的天然的β-内酰胺酶获得[7]。CTX-M基因型在我国为主要的类型，同时在广州也是以CTX-M型为主[8]。产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌中SHV基因型检出率为29.2%，单纯SHV基因型为9.2%，而CTX-M+SHV为7.7%，CTX-M+TEM+SHV为9.2%。此外TEM基因型检出率为29.3%，单纯TEM基因型为10.8%，而CTX-M+TEM为 6.2%，CTX-M+TEM+SHV为9.2%。SHV基因型和TEM基因型，在我国并不是主要的肺炎克雷伯菌基因类型[9]，相反在美国、法国等国家是主要的主要流行的基因型[10]。在国内不同区域也是不一致的，在山西则是以TEM基因型为主[11]。

表4 200株肺炎克雷伯菌耐药情况

不同基因型耐药性分析

CTX-M基因型的肺炎克雷伯菌的水解底物为青霉素类的抗生素，包括了第一代和第二代青霉素类抗生素，有研究显示对于第三代青霉素类抗生素具有选择性，其对于头孢噻肟的选择性高于头孢吡肟，会优先水解头孢噻肟，有部分的CTX-M基因型的肺炎克雷伯菌可水解头孢吡肟，这可能是与CTX-M基因型的不同类型有关[12]。从本研究的中CTX-M基因型的药敏实验可以证实这个观点，37株CTX-M基因型中，全部菌株对头孢噻肟耐药，而头孢吡肟的耐药率为34株（91.9%）。但是从头孢吡肟药敏结果来看，头孢吡肟的耐药性较高，可能是CTX-M基因上的一些氨基酸位点发生改变导致对头孢吡肟的水解能力增强。同时在CTX-M基因还存在交叉耐药性，除青霉素类外，也具有耐药性，这可能是CTX-M基因肺炎克雷伯菌通过转化、接合和转导能方式，获得相关的耐药基因。此外药敏研究显示单纯CTX-M基因肺炎克雷伯对亚胺培南和美洛配能没有产生耐药性。

同时SHV基因型和TEM基因型在本研究中，对于头孢噻肟的耐药性是高于头孢吡肟，[13]。有研究显示SHV基因型对头孢噻肟的耐药性是高于头孢吡肟，本研究从侧面也反应这点[14]。对于TEM基因型有研究显示，其对于头孢他啶的水解能力要高与头孢噻肟，但是在本研究中头孢他啶的耐药性是低于头孢噻肟[15]。这可能是与本地区头孢他啶的使用相关。本研究中SHV基因型和TEM基因型的肺炎克雷伯菌对于亚胺培南和美洛配能显示出高的敏感性。

随着第三代头孢菌素类药物的使用，产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌的的检出增加。对其流行状况、基因类型和耐药性进行监测，可切断产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌的相关的耐药质粒传播途径，指导临床上抗肺炎克雷伯菌的使用，减少肺炎克雷伯菌在院内的感染。

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