儿茶酚胺在束缚应激大鼠肺损伤中的作用

李 莉，张晓静，刘 威，宋 宁，喻昌利*

(1.华北理工大学附属医院呼吸内科，河北 唐山 063000；2.河北医科大学法医系，河北省法医学重点实验室，河北 石家庄 050017；3.河北省胸科医院骨科，河北 石家庄 050042；4.河北医科大学第二医院感染科，河北 石家庄 050000)

·论 著·

儿茶酚胺在束缚应激大鼠肺损伤中的作用

李 莉1，张晓静2，刘 威3，宋 宁4，喻昌利1*

(1.华北理工大学附属医院呼吸内科，河北 唐山 063000；2.河北医科大学法医系，河北省法医学重点实验室，河北 石家庄 050017；3.河北省胸科医院骨科，河北 石家庄 050042；4.河北医科大学第二医院感染科，河北 石家庄 050000)

目的研究儿茶酚胺(catecholamine，CA)在束缚应激大鼠肺损伤中的作用。方法选取成年SD雄性大鼠15只，随机分为对照组、束缚应激组、束缚+酪氨酸羟化酶抑制剂(alpha-methyl-p-tyrosine，AMPT)组，每组5只。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆中去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)水平，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法观察肺组织病理形态学变化，ELISA法检测肺组织中白细胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)的浓度，二辛可酸法检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中蛋白的含量。结果束缚应激组、束缚+AMPT组血浆中NE、E水平显著高于对照组，束缚+AMPT组血浆中NE、E水平显著低于束缚应激组(P<0.05)；束缚应激组、束缚+AMPT组肺组织中IL-1β、IL-6浓度和BALF中蛋白含量均显著高于对照组，束缚+AMPT组肺组织IL-1β、IL-6浓度和BALF中蛋白含量显著低于束缚应激组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论束缚应激可致肺损伤，CA可能参与这一损伤过程，AMPT可明显减轻肺损伤。

肺损伤；儿茶酚胺；束缚应激

应激是指机体受到各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应，也称应激反应[1]。根据其来源不同，应激原大致分为三类：外环境因素、内环境因素和心理社会因素[2]。现代社会生活步伐加快，人们总是面临着生活、工作和情感压力的超负荷，这些超负荷可以作为心理社会因素使机体处于应激状态。适度应激一方面可以调动机体的非特异性免疫系统，增强对疾病的抵抗力，具有重要的防御代偿意义；另一方面，过度持久的应激会打破内部环境的稳定状态，引起多种应激相关性疾病。应激对健康的影响以及应激相关性疾病的防治已经成为亟待解决的医学问题。应激时，激活多种神经和内分泌反应，其中起主要作用的是下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴和交感神经系统(sympathetic nervous system，SNS)[1]，交感神经系统激活后释放儿茶酚胺(catecholamine，CA)。CA是一组含有儿茶酚或3,4-二羟基苯基和胺基的物质，由去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)共同组成，是重要的应激激素。束缚应激模型是公认的复制心理社会应激的动物模型[3]。有研究表明束缚应激对大鼠孤束核[4]、肠道[5]的损伤作用均与CA有关。离体实验的研究表明应激激素CA可以激活巨噬细胞产生炎症因子[6]。肺脏富含巨噬细胞，那么应激时肺脏是否会发生炎症反应，目前尚不明确。因此，本研究拟建立束缚应激的动物模型，旨在探讨束缚应激对肺脏炎症反应的影响以及CA在其中的作用。报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源 清洁级SD雄性大鼠15只，体质量230～250 g，购自河北省实验动物中心，恒温(23±2) ℃，湿度45%～65%，每日光照12 h。合格证：1604027。采用随机数字表法将15只大鼠随机分为对照组、束缚应激组、束缚+酪氨酸羟化酶抑制剂(alpha-methyl-p-tyrosine，AMPT)组，每组5只。所有实验过程严格遵循科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 实验方法 ①对照组：每日相应时间禁食水，其余时间自由活动。②束缚应激组：将大鼠按照固定时间放入束缚模具内(束缚模具由透明材质制成，长约20 cm，直径约5 cm，前后两端及侧壁均有对称的透气孔)，束缚时间为第1天、第2天晚22:00至次日早06:00(8 h)，第3天、第4天晚22:00至次日早08:00(10 h)，第5天至第7天晚20:00至次日早10:00(12 h)，7 d为1个周期，连续束缚14 d。③束缚+AMPT组：大鼠在每日束缚应激前2 h腹腔注射AMPT(100 mg/kg)，其余时间自由活动，共14 d。

1.3 体质量测定 每天实验后于固定时间测量并记录对照组与束缚应激组大鼠体质量，以评价束缚应激模型是否成功建立。

1.4 CA浓度检测 于造模结束后用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mL/100 g)后，打开腹腔，将腹腔脏器向一侧翻转，剥离腹主动脉筋膜组织，用一次性采血针做腹主动脉穿刺可见回血后，另一端插入真空管中抽取血液，离心机离心(13 000 r/min，15 min)取上清，-80 ℃冰箱保存待用。应用CatCombi ELISA 试剂盒检测NE、E水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 肺组织病理形态学观察 腹主动脉放血处死后，取左肺叶，冰生理盐水快速冲洗干净，10%中性福尔马林固定48 h，常规石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，光镜下观察肺形态学变化。

1.6 肺组织IL-1β、IL-6检测 腹主动脉放血处死后，取右肺叶，冰生理盐水中快速冲洗干净后立即放入液氮，-80 ℃保存待用。每100 mg组织中加入500 μL裂解液制备匀浆后10 000 r/min，5 min，4 ℃离心取上清，采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定组织中的白细胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 BALF蛋白含量检测 腹主动脉采血处死后，剪开颈、胸部皮肤，暴漏气管并行气管插管。用20 mL冰生理盐水分2次进行整肺灌洗(灌洗时保证每次打入、吸出等体积的液体)，收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)置冰上，离心(4 ℃，1 500 r/min，10 min)，收集上清液，-80 ℃保存待用。用二辛可酸法测定BALF中蛋白的含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.8 统计学方法 应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料比较分别采用t检验、单因素方差分析和q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体质量变化 造模14 d后，束缚应激组体质量明显低于对照组[(253.17±2.35) gvs(275.11±4.40) g]，差异有统计学意义(t=7.611，P<0.05)。提示成功复制大鼠束缚应激模型。

2.2 大鼠血浆中NE、E水平变化 束缚应激组、束缚+AMPT组血浆中NE、E水平显著高于对照组，束缚+AMPT组血浆中NE、E水平显著低于束缚应激组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血浆中NE、E水平比较Table 1 Comparison of NE and E levels in plasma of rats in each group

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与束缚应激组比较(q检验)

2.3 肺组织病理形态学变化 对照组肺泡充气良好，肺泡及间质无炎性细胞浸润、无水肿、无血液渗出，肺泡隔无增厚，肺毛细血管轻度淤血；束缚应激组肺泡隔增厚，肺泡腔及间质内炎性细胞浸润，部分肺泡塌陷、不张，肺毛细血管中度淤血；与束缚应激组相比，束缚+AMPT组肺组织病理学变化有所减轻，肺泡充气较好，间质及肺泡内炎性细胞及血液渗出减少，间质水肿减轻，肺毛细血管淤血减轻(图1)。

图1 大鼠HE染色结果(光镜 ×200)
A.对照组;B.束缚应激组;C.束缚+AMPT组
Figure 1 Results of HE staining in rats(light microscope ×200)

2.4 肺组织中IL-1β、IL-6浓度及BALF中蛋白含量变化 束缚应激组、束缚+AMPT组肺组织中IL-1β、IL-6浓度和BALF中蛋白含量均显著高于对照组，束缚+AMPT组肺组织IL-1β、IL-6浓度和BALF中蛋白含量显著低于束缚应激组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组肺组织中IL-1β、IL-6浓度及BALF中蛋白含量比较Table 2 The protein content of BALF, IL-6 and IL-1β in lung tissue of each group

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与束缚应激组比较(q检验)

3 讨 论

虽然现在关于应激的研究越来越多，但国内外学者对于应激相关性疾病的研究主要集中在心血管系统[7]、消化系统[8]、免疫系统[9]及精神神经系统[10]等，关于应激对肺脏的影响少有文献报道。肺脏是全身静脉血液的过滤器官，其受损后易发生急性呼吸窘迫综合征，严重时甚至会出现呼吸衰竭，影响循环系统和中枢神经系统的功能，加速多器官功能衰竭综合征的发生[11]。因此，研究应激对肺脏的影响有重要的意义。

随着应激研究的不断深入，动物模型的构建成为研究成功的关键。而束缚应激模型是公认的复制心理应激的经典动物模型[3]。有实验表明，束缚大鼠时间不同，可引起大鼠不同程度的应激反应[12]。鉴于重复束缚应激与单次束缚应激对机体的影响不同，研究者可以根据具体的研究目的选择具体的束缚方式。相对急性束缚应激，慢性束缚应激更符合人身心疾病的发生发展过程，更具有实际意义，本研究采用慢性束缚应激模型。机体对应激原刺激有一定适应性，只有不断改变应激方式或强度才能最大程度减弱适应反应[13]。因此，本实验采用逐渐增加每日束缚时间增加应激强度，减弱动物的适应性。

束缚应激模型建立后，监测体质量变化是一种简便、有效评价束缚应激模型的方法[14]。本研究结果显示，束缚14 d时，束缚应激组大鼠体质量明显低于对照组，证明成功建立了束缚应激模型。应激使大鼠束缚后体质量增长减缓的原因可能有以下几点：①束缚应激时动物处于超热状态，能量物质消耗增加；②应激状态下动物进食量减少；③应激时糖皮质激素和CA水平升高，使机体的血糖和游离脂肪酸含量均升高，导致机体分解代谢增加，体质量增长减缓[15]。

应激过程中神经内分泌反应主要包括HPA轴和SNS[1]。有研究表明，长期应激时糖皮质激素的作用逐渐衰减，SNS的作用逐渐凸显出来[16]。SNS激活后释放CA，CA一方面可激活免疫细胞，增强局部炎症反应，使促炎因子产生增加[17]；另一方面，可以通过抑制T细胞功能抑制免疫反应。提示CA在神经免疫调节中具有重要作用。肺脏富含多种免疫细胞，可以分泌多种炎症因子，免疫细胞的激活参与多种肺脏疾病的发生发展 。因此，研究CA对肺脏炎症反应的影响，对于阐明肺癌[18]、哮喘[19]等与应激有关疾病的发病机制具有重要意义。

本研究检测了大鼠外周血CA水平，束缚应激组血浆中NE、E水平显著高于对照组。提示束缚应激使大鼠产生了一定强度的应激反应。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是CA合成的限速酶[20]。酪氨酸经TH转化成左旋多巴，然后左旋多巴脱羧生成多巴胺，多巴胺再通过多巴胺β-羟化酶最终转化为NE，最后NE通过苯乙醇胺N-甲基转移酶转化为E。所以，TH在生物体内活性和表达的变化直接影响CA的生物合成[21]。本研究显示应用AMPT可以明显降低NE、E水平。本研究进一步观察了肺组织病理学变化，束缚应激组肺组织出现比较明显的炎症改变；此外，束缚应激组肺组织中IL-1β、IL-6水平及BALF中蛋白含量均高于对照组。提示束缚应激可以引起肺损伤，而给予AMPT可以明显减轻束缚应激引起的肺脏炎症改变，表明束缚应激所致肺损伤可能与CA升高有关，抑制TH可明显减轻肺损伤。有研究表明，CA可以作用于巨噬细胞，巨噬细胞被激活后可释放活性氧和其他炎症因子[22]。细胞研究证实，阻断巨噬细胞来源的CA可以大大减轻肺炎症反应[23-24]。给临床工作提供了新的启示，即在临床对患有感染性疾病的患者治疗时，降低心理应激的负面影响可能有助于降低休克发病率和病死率，从而有利于疾病的治疗。

综上所述，本研究证实束缚应激可致肺损伤，CA可能参与这一损伤过程，AMPT可明显减轻肺损伤。

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(本文编辑：赵丽洁)

Effects of catecholamines on lung injury induced by restraint stress in rats

LI Li1, ZHANG Xiao-jing2, LIU Wei3, SONG Ning4, YU Chang-li1*

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China; 2.DepartmentofForensicMedicine,HebeiMedicalUniversity,HebeiKeyLaboratoryofForensicMedicine,Shijiazhuang050017,China; 3.DepartmentofOrthopedics,HebeiChestHospital,Shijiazhuang050042,China; 4.DepartmentofInfectiousDisease,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To study the effect of catecholamine(CA) on lung injury in rats with restraint stress. Methods Fifteen adult male SD rats were randomly divided into control group, restraint stress group and restraint+alpha-methyl-p-tyrosine(AMPT) group, 5 rats in each group. Both plasma norepinephrine(NE), epinephrine(E) and interleukin-1 beta(IL-1β), interleukin-6(IL-6) concentration were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Hematoxylin-eosin(HE) staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. The protein levels in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were detected by bicinchoninic acid method. Results Compared with the control group, the plasma NE and E levels in the restraint stress group, restraint+AMPT group were significantly higher than those in the control group. Compared with the restraint stress group, the levels of NE and E in plasma of the restraint+AMPT group were significantly lower than those in restraint stress group(P<0.05). Compared with the control group, the levels of IL-1β, IL-6 in the lung tissue and BALF protein content of the restraint stress group and restraint+AMPT group were significantly increased. Compared with the restraint stress group, the levels of IL-1β, IL-6 and BALF in the lung tissue of the restraint+AMPT group were significantly decreased, the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion Catecholamine may be involved in the lung injury induced by restraint stress. AMPT can significantly reduce the lung injury induced by restraint stress.

lung injury; catecholamine; restraint stress

2016-11-15；

2017-03-06

国家自然科学基金资助课题(81202382)

李莉(1989-)，女，河北石家庄人，华北理工大学附属医院医学硕士研究生，从事呼吸内科疾病诊治研究。

R563

A

1007-3205(2017)05-0501-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.002

*通讯作者