细叶石斛离体快速繁殖研究

刘清,包英华*,毛怡霏,黎幸欣,白音

细叶石斛离体快速繁殖研究

刘清,包英华*,毛怡霏,黎幸欣,白音

（韶关学院英东生命科学学院,广东韶关512005）

为了解决细叶石斛自然繁殖率低、市场种源短缺的问题，采用细叶石斛种子为材料，通过无菌萌发、原球茎增殖、原球茎分化和生根壮苗等离体快速繁殖过程获得组培苗.实验结果表明：1/2 MS+6%马铃薯粉培养基适合于原球茎形成和增殖；1/2 MS+6%马铃薯粉+0.8%花宝1号培养基可用于细叶石斛的原球茎分化和生根壮苗.共培养6～8月，细叶石斛组培苗的株高、茎粗、分蘖数、叶片数、根数和根长等指标分别达到4.43 cm、0.16 cm、1.76株、8.20片、5.48条和2.16 cm，而且栽后成活率可达97.94%.

细叶石斛；植物组织培养技术；离体再生；组培苗

细叶石斛(Dendrobium hancockiiRolfe)又名石竹、草石斛、黄草［1］，为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物.茎直立，质地较硬，圆柱形或纺锤形，通常分枝；叶互生，狭长圆形，基部具革质鞘；总状花序具1~2朵花，花质地厚，具香气，金黄色，花期5~6月［2］.生于海拔700~1 500 m的山地林中树干上或山谷岩石上.分布于陕西秦岭以南、甘肃南部、河南、湖北东南部、湖南东南部、广西西北部、四川南部至东北部，贵州南部至西南部，云南东南部等地区［2］.

细叶石斛是药兼观赏两用植物.首先它是黄草石斛(又称川石斛)细黄草的主要来源植物之一［3-5］，茎入药性寒、味甘，有滋阳清热、养胃生津之功效.陈云龙等［6］研究结果表明，细叶石斛茎中总多糖含量较高，其水溶性提取物强烈拮抗苯肾上腺素所致的大鼠胸主动脉血管收缩作用.其次是细叶石斛的观赏价值极高，其花姿优雅，花色鲜艳，气味芳香，生命力旺盛，被喻为“四大观赏洋花”之一，可作盆栽观赏.李崇辉等［7］实验结果指出，细叶石斛花中的主要挥发性成分为3-蒈烯，3-蒈烯是花、果香气的重要成分之一，是重要的香料资源，也有很好的药用活性［8］.

由于受到环境因素制约和人为过度采伐，细叶石斛野生资源日趋濒危，而其需求量却日益增大.因此，加强细叶石斛自然资源保护及扩大种植面积是目前最重要的研究课题.利用植物离体培养技术，进行细叶石斛离体培养和保存，可以提高其繁殖率，也可以缩短栽培的时间，有利于细叶石斛种质资源的保存.

本文以细叶石斛种子为实验材料，采用植物组织离体培养技术，在无激素培养基上对其种子进行离体培养，经过原球茎形成、原球茎增殖、原球茎分化及壮苗等过程，获得细叶石斛组培苗，再将组培苗炼苗后移栽到栽培基质中，观察记录其成活率.以期为细叶石斛今后的开发利用，即其植物组织离体培养技术与规模化种植栽培相结合扩大生产提供实验依据.

1试验材料

细叶石斛果实若干颗，采自于韶关学院石斛种质资源圃.

2主要仪器和试剂

仪器：立式压力蒸汽灭菌器(1575S-34)，接种器械灭菌器(JB-CJ-1500U)，超净工作台(JB110222-05)，电热干燥箱(21118068)，光照培养架、电子天平，游标卡尺等.

试剂：MS培养基，马铃薯粉，花宝1号.

3实验方法

3.1培养基配制与灭菌法

采用潘瑞炽等法［9］配制培养基，培养基种类见表1.培养基分装后，121℃高压灭菌30 min，将其冷却凝固，放置3 d，若无污染现象，即可使用.将所用工具清洗干净，晾干，用布条包扎后，在121℃高压灭菌30 min后，放入烘箱中烘干，备用.

3.2种子表面消毒和接种法

挑选饱满、未裂开的蒴果，用自来水冲洗15 min，轻轻擦拭表面.在超净工作台上，将洗净的蒴果用75%乙醇浸泡60 s，无菌水冲洗2~3次；再用0.1%升汞浸泡10~12 min，无菌水冲洗5~6次，吸干蒴果表面水分，备用.用解剖刀切开果实，将种子分别接种于培养基1和培养基2上进行培养.培养室温度为26±2℃，光照强度为2 000~2 500 lx，光照时间12 h/d.每隔15 d观察一次.

3.3原球茎和小苗转接法

种子培养经30 d后形成原球茎.原球茎形成后将其转接于培养基2上，进行原球茎增殖培养.每隔30 d转接一次相同新鲜培养基上(共转接2次).增殖的原球茎再转接于培养基3上，进行丛生芽形成和壮苗生根培养.每隔60 d将小苗转接一次相同新鲜培养基上(共转接2次)，每瓶接6~8丛，3~5株为一丛.培养条件和观察法与3.2相同.

3.4组培苗测量法

待组培苗长到约5 cm时，挑选出50瓶组培苗.将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，每瓶取5丛苗为一组，测量和记录各组组培苗的株高(cm)、长势情况、茎粗(cm)、叶片数(片)、叶片颜色、根长(cm)、根数(条)、根颜色和分蘖数(个)等指标.数据采用SPSS21.0软件进行处理和分析，结果用“均值±标准差”表示.

3.5组培炼苗和移栽法

甁苗在种植石斛温室大棚内放置10 d进行炼苗.移栽时洗净组培苗根部，浸泡于低浓度多菌灵液中约30 s，晾干根部表明的水分，然后把组培苗分为10~15株/丛移栽在基质上.移栽丛距和行距约为10 cm×10 cm.移栽7d内空气湿度要保持在90%左右，利于幼苗成活.7 d后空气水分含量保持湿度在70~80%，促使苗生根发芽，用湿温度计测量湿度和温度.移栽135 d后，统计组培苗的成活率.

表1培养基种类

4结果与分析

4.1细叶石斛原球茎形成和增殖培养

将细叶石斛种子分别接种于培养基1和培养基2上，一颗果实内的种子约接种于13瓶培养基(见表2、图1中A、B、C).培养约30 d后开始形成原球茎(见图1中D)，原球茎呈小圆锥状.共培养60 d后发现，培养基1上的部分种子不萌发，颜色逐变淡黄色(见图1中E)，故淘汰，淘汰率达30%，已形成的原球茎，颜色淡绿色，体积较小；培养基2上的种子均可形成深绿色且较大的原球茎(见图1中F).培养基1和培养基2上形成的原球茎，均转接于新鲜配制的培养基2上，进行原球茎增殖培养(见图1中G).增殖培养60 d后，原球茎颜色变深绿色，且原球茎顶端有叶原基突起，并逐步分化成绿色丛生芽，有些还生出白色短根(见图1中H).

表2细叶石斛原球茎形成情况

图1细叶石斛原球茎形成和增殖分化情况

4.2细叶石斛无根苗生根和壮苗培养

将培养基2上形成的细叶石斛无根苗，约长到1.0 cm时，转接于培养基3上，进行无根苗的生根和壮苗培养，每瓶接6~8丛(3~5株/丛)(图2中A、B).每隔60 d转接于新鲜配制的培养基3上，共转接2次，培养出组培苗(图2中C).培养结果表明，培养基3上，无根苗长势好，健壮，整齐，颜色为深绿色，生根率也高，根颜色为白色逐渐变为浅绿色，质地较硬(图2中D).

图2细叶石斛无根苗转接和生根壮苗情况

4.3细叶石斛组培苗培养过程中的污染问题

在细叶石斛种子萌发形成原球茎、原球茎增殖和分化及生根壮苗过程中，均会出现细菌和霉菌污染问题，且污染率较高.细菌污染在接种后1~2 d即可发现，霉菌污染则在3~10 d后出现.细菌污染后培养基表面呈现粘液状物，培养材料的生长发育被受限制，逐渐黄化或褐化死亡(见图3中A、B)；真菌污染则培养基表面长出肉眼可看出的不同颜色霉菌，培养材料一旦被真菌污染，真菌菌落会迅速增殖，覆盖整个培养基或材料表面，导致培养材料死亡(见图3中C、D).

注：A：原球茎细菌污染；B：组培苗细菌污染；C：原球茎真菌污染；D：组培苗真菌污染.

统计结果表明，细叶石斛种子接种后在培养基1和2上的污染率分别可达11.25%和10.31%；原球茎增殖培养过程中的污染率可达12.37%；生根壮苗过程中的污染率可达6.21%.

4.4细叶石斛组培苗品质分析

共培养6~8月后，可观察细叶石斛组培苗的定性和定量特征.结果表明，培养基3上，组培苗长势比较好，较整齐，茎较粗壮，叶片深绿色，根基部浅绿色，上部浅黄色.组培苗株高、茎粗、分蘖数、叶片数、根数和根长等指标分别达到4.43 cm、0.16 cm、1.76株、8.20片、5.48条和2.16 cm(见图4中A、B).移栽后约60 d，细叶石斛组培苗开始长出新芽和新根，根系逐渐变得粗壮.在栽后135 d的统计结果表明，培养基3上培育出的组培苗成活率可达97.94%(见图4中C、D).

图4细叶石斛组培苗测量和栽后成活情况

5结论

通过对细叶石斛种子作材料，进行其离体快速繁殖研究，可以为保护细叶石斛种质资源和扩大种植提供参考依据.本文研究发现，细叶石斛组培苗的培养可以采用无激素培养基，但需要有机附加物的添加.添加马铃薯粉能够促进细叶石斛种子形成原球茎和原球茎增殖概率，同时添加马铃薯粉和花宝1号可以促进细叶石斛原球茎出丛生芽和无根苗的生根效率.

实验结果表明，1/2 MS+6%马铃薯粉培养基上细叶石斛原球茎形成和增殖快，原球茎呈深绿色，这与莫昭展等［10-11］的在1/2 MS添加不同激素的培养基上细叶石斛原球茎增殖较快，但原球茎水渍状明显，有玻璃化倾向结果有所差别，说明激素对细叶石斛原球茎形成和增殖虽然促进作用，但原球茎的玻璃化和褐化问题产生也有一定的影响.

在实验过程中出现的污染问题，主要来源于首先接种室洁净度不够，培养基灭菌不彻底或灭菌完后培养瓶盖变松；其次是接种时实验操作不规范和人员走动频繁造成的.因此，细叶石斛组培苗工厂化生产时，应注意上述污染来源.

本实验由于时间所限，细叶石斛组培苗培养整个过程中所用的培养基种类比较少，对其他的基本培养基和有机附加物对其影响今后再需要进一步实验.

参考文献：

［1］黎明,刘保国,卫红,等.细叶石斛营养器官的解剖学研究[J].河南农业科学,2005(5):58-61.

［2］中国科学院《中国植物志》编委会.中国植物志(第19卷)[M].北京:科学出版社,1999.

［3］沙文兰,罗金裕.中药石斛鉴定研究I.石斛原植物和药材的调查[J].药学学报,1980,15(6):351-357.

［4］吉占和.中国石斛属的初步研究[J].植物分类学报,1980,18(4):472.

［5］赵菊润.黄草石斛的药源变迁[J].内蒙古林业调查设计,2014,37(2):100-102.

［6］陈云龙,张铭,何国庆,等.细叶石斛有效成分分析及其水溶性提取物的血管舒张活性[J].植物资源与环境学报,2003,12(1):6-9.

［7］李崇晖,黄明忠,黄少华,等.4种石斛属植物花朵挥发性成分分析[J].热带亚热带植物学报,2015,23(4):454-462.

［8］何丽芝,王婧,赵振东,等.3-蒈烯资源及其生物活性应用研究进展[J].林产化学与工业,2011,31(3):122-126.

［9］潘瑞炽.植物细胞工程[M].广州：广东高等教育出版社,2008.

［10］莫昭展,林凤华,韦江萍.细叶石斛原球茎和丛生芽增殖的研究[J].玉林师范学院学报,2007,28(3):61-64.

［11］莫昭展,施福军,梁海清,等.细叶石斛原球茎组培褐化抑制与试管苗生根[J].林业科技开发,2009,23(2):22-24.

The Study of In-vitro Rapid Propagation ofDendrobiumhancockiiRolfe

LIU Qing,BAO Ying-hua*,MAO Yi-fei,LI Xing-xin,BAI Yin
（Yingdong College of Life Sciences,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China）

The natural reproduction rate ofDendrobiumhancockiiRolfe was low and the lack of provenance on the market.It used the seeds ofD.hancockiiRolfe as material and methods of aseptic germination,protocorm multiplication and differentiation,rooting and growth-promoting to assist in solving these problems.The results show that the culture medium 1/2 MS+6%potato starch is suitable for formation and multiplication of protocorm.1/2 MS+6%of patatostarch and 8%of No.1 Huabao can be used for the differentiation of protocorm and rooting and growth-promoting.The plant height,stem diameter,tiller number,leaf number,root number,root length of tissue culture seeding ofD.hancockiiRolfe are 4.43 cm,0.16 cm,1.76,8.20,5.48 and 2.16 cm respectively，and the survival rate is 97.94%after transplanting.

DendrobiumhancockiiRolfe;plant tissue culture technology;in vitro regeneration;tissue culture seeding

Q94%

A%%%

1007-5348（2017）03-0077-05

（责任编辑：闫文龙）

2017-03-15

广东省科技计划项目(2013B040200015)；2015广东省“质量工程”项目；2016年广东省省级大学生创新创业训练项目(201610576027).

刘清(1994-)，广东信宜人，韶关学院英东生命科学学院生物科学专业2013级学生.*通讯作者.