黄芩苷在原代心肌细胞氧化损伤中的保护作用及机制研究

2017-05-17邱丽满林婧褚剑锋林久茂彭军

福建中医药 2017年2期

邱丽满，林婧，2，褚剑锋，2，3，林久茂，2，彭军，2，3

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122；3.福建中医药大学陈可冀学术思想传承工作室，福建福州350122）

邱丽满1，林婧1，2，褚剑锋1，2，3，林久茂1，2，彭军1，2，3

目的通过体外实验研究黄芩苷在心肌细胞氧化损伤中的保护作用及其机制。方法取SD乳鼠心肌细胞进行原代培养，按各实验需要分组并干预。采用MTT法检测不同剂量黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型中细胞活力的影响，采用Western Blot法检测不同剂量黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型DNA双链断裂损伤指标γ-H2AX和核内β-catenin表达的影响，并用Wnt／β-catenin信号通路激活剂LiCl干预，进一步探讨黄芩苷在对心肌氧化损伤细胞模型的保护机制。结果心肌氧化损伤细胞模型的细胞活力显著下降，γ-H2AX和核内βcatenin的蛋白表达明显上调；低剂量黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型的细胞活力和γ-H2AX、核内β-catenin的表达无明显影响；而中、高剂量黄芩苷能够明显阻止受损心肌细胞活力下降，并下调心肌氧化损伤细胞模型的γ-H2AX和核内β-catenin的表达；且高剂量黄芩苷能够下调Wnt／β-catenin信号通路激活剂LiCl干预下的原代心肌细胞γ-H2AX和核内β-catenin的表达水平。结论黄芩苷能够通过抑制Wnt／β-catenin信号通路，阻止心肌细胞氧化损伤。

黄芩苷；心肌细胞氧化损伤；γ-H2AX；Wnt／β-catenin信号通路

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是严重危害人类健康与生命的心血管病急症，其死亡率极高。在缺血心肌中，未修复的缺血损伤所引起的DNA损伤和活性氧（ROS）的产生，被认为是心肌细胞氧化损伤的主要机制［1-3］。DNA双链断裂是一种致命的DNA损伤，其断裂部位产生的γ-H2AX能够募集损伤修复相关蛋白到损伤位点，最终引起DNA修复等反应［4，5］。H2O2是一种重要的ROS，它可作为第二信使刺激和调节DNA损伤的发生［6］。我们的前期研究发现：抑制Wnt／β-catenin信号通路在阻止心肌缺血DNA损伤的发生及促进DNA修复中具有重要意义［7］。

中药单体黄芩苷（baicalin）是一种从中药黄芩干燥根部提取出来的活性成分。越来越多的研究表明，黄芩苷具有良好的心脏保护作用［8-10］，但其保护机制仍不明确。因此，我们拟用H2O2刺激原代心肌细胞建立心肌氧化损伤细胞模型，通过实验明确黄芩苷对氧化损伤的心肌细胞的保护作用，并探讨其可能的保护机制。

1材料

1.1药物和动物黄芩苷购于成都曼思特生物科技有限公司；新生SD（Sprague-Dawley）乳鼠购于上海杰斯捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2013-0006。

1.2试剂DMEM低糖培养基（维森特生物技术有限公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素混合液（双抗）、0.25%含EDTA胰酶、0.1%不含EDTA胰酶（美国Thermo公司）；LiCl（美国Sigma公司）；细胞核和胞质蛋白提取试剂盒、DMSO（上海生工生物工程股份有限公司）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；β-catenin抗体、GAPDH抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；γ-H2AX抗体、TFIIB抗体（英国Abcam公司）；二抗（美国Thermo公司）。

1.3主要仪器二氧化碳培养箱、恒温磁力搅拌器（美国Thermo公司）；倒置显微镜系统（德国Leica仪器有限公司）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；化学发光显影仪（美国GE公司）。

2方法

2.1试剂配置黄芩苷用DMSO配制成储存液，分装于-20℃贮存备用。DMEM低糖完全培养基含10%FBS和1%双抗，4℃冰箱保存备用。

2.2原代心肌细胞培养及心肌氧化损伤细胞模型的建立取出生1～3 d SD乳鼠的心脏组织于预冷的PBS内，清洗后剪碎，用0.01%不含EDTA胰酶分多次消化（37℃水浴，100 rpm，搅拌10 min），每次消化得到的细胞悬液于20%FBS的完全DMEM培养基（低糖）中和；离心1 000 rpm，7 min，弃上清，用完全培养基重悬后纱网过滤，将细胞铺在φ10cm培养皿中；利用差异贴壁分离得到心肌细胞，接于φ3.5 cm培养皿中，置于37℃、5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，24 h后更换培养基，48 h后用PBS清洗并更换培养基用于后续实验。用H2O2刺激原代心肌细胞诱导心肌氧化损伤细胞模型的建立。

2.3采用MTT法检测细胞活力将取得的原代心肌细胞分成对照组、低剂量组（10 μM黄芩苷）、中剂量组（25 μM黄芩苷）、高剂量组（50 μM黄芩苷）和模型组（200 μM H2O2）、模型＋低、中、高剂量组。黄芩苷预处理24 h后，用H2O2干预2 h，建立心肌氧化损伤细胞模型。PBS清洗细胞后每孔加0.1 mL的MTT（0.5 mg／mL）于细胞培养箱内孵育4 h，弃MTT，加入DMSO后震荡，通过酶标仪测定570 mm波长下各孔吸光度值，并进行数据分析及图表制作。

2.4采用Western Blot法检测γ-H2AX和核内βcatenin的表达将取得的原代心肌细胞分成对照组、模型组（100 μM H2O2）、模型＋低、中、高剂量组，用于检测黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型γ-H2AX和核内β-catenin表达的影响。将取得的原代心肌细胞分成对照组、黄芩苷组（50 μM黄芩苷）、LiCl组（10 mM LiCl）、黄芩苷＋LiCl组（50 μM黄芩苷＋10 mM LiCl），用于检测黄芩苷对Wnt／βcatenin信号通路激活剂LiCl诱导下的γ-H2AX和核内β-catenin表达的影响。黄芩苷、LiCl预处理24 h后，用H2O2干预30 min，建立心肌氧化损伤细胞模型。提取细胞总蛋白、核蛋白，采用Western Blot法检测各组细胞γ-H2AX和细胞核内β-catenin表达的影响，并用凝胶成像系统进行图像数据分析。

2.5统计学方法实验数据采用SPSS 20.0版本软件进行统计分析。计量资料采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。

3结果

3.1黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型细胞活力的影响MTT结果表明：低、中、高剂量黄芩苷单独干预对正常原代心肌细胞的细胞活力无明显影响，结果见图1A。低、中、高剂量黄芩苷能够明显改善氧化受损心肌细胞的活力，尤其中、高剂量黄芩苷改善更为明显，结果见图1B。

图1黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型细胞活力的影响

3.2黄芩苷对心肌损伤细胞模型细胞γ-H2AX和核内β-catenin蛋白表达的影响Western Blot结果显示：与对照组相比，心肌氧化损伤细胞模型组的γ-H2AX和细胞核内β-catenin的表达显著上调；与模型组比较，低剂量黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型γ-H2AX和核内β-catenin的表达变化无明显影响，而中、高剂量黄芩苷能够显著下调心肌缺血损伤细胞模型γ-H2AX和核内β-catenin的表达，提示黄芩苷可能通过抑制β-catenin，调控Wnt／β-catenin信号通路，进而下调心肌氧化损伤细胞模型γ-H2AX的表达。结果见图2。

图2黄芩苷对心肌氧化损伤细胞模型γ-H2AX和核内β-catenin蛋白表达的影响

3.3黄芩苷对LiCl诱导下的γ-H2AX和核内βcatenin蛋白表达的影响Western Blot结果显示：黄芩苷单独干预能够明显下调心肌原代细胞核内β-catenin的表达，且对γ-H2AX的表达无影响；用Wnt／β-catenin信号通路的激活剂LiCl单独干预能够显著上调心肌原代细胞γ-H2AX及其核内βcatenin的表达，表明促进Wnt／β-catenin信号通路活化能够增加原代心肌细胞γ-H2AX的表达；而与LiCl干预组比较，黄芩苷＋LiCl组的γ-H2AX和核内β-catenin的表达水平显著降低，表明黄芩苷能够抑制LiCl对Wnt信号通路的激活作用，进而下调氧化损伤心肌细胞γ-H2AX的表达，结果见图3。

图3黄芩苷对LiCl诱导下的γ-H2AX和核内β-catenin蛋白表达的影响

4讨论

目前，临床上治疗AMI的方法主要是抗血小板凝集、溶栓等药物治疗以及建立侧枝循环的手术治疗等［11-13］，这些急救措施主要局限于处理已经闭塞的血管，使其再通，从而恢复心肌的血供，但是，这些治疗手段并不能挽救已经发生不可逆损伤的缺血组织。显然，只有阻止细胞死亡，才能对其后续血管再通、血管新生的治疗提供良好的治疗基础。

组织发生缺血时，短时间内细胞内ROS大量增多，超过细胞抗氧化处理能力，导致机体处于氧化应激状态并诱发DNA氧化性损伤，DNA损伤是缺血导致的组织损伤最早出现的反应［14］，过度的DNA损伤会导致细胞死亡。阻止及修复DNA损伤，将有望阻止心肌发生不可逆性损伤，为心肌缺血的治疗延长治疗时机。

我们的研究发现：黄芩苷能够明显阻止心肌缺血损伤细胞模型中细胞活力的下降，下调细胞DNA双链断裂指标γ-H2AX及细胞核内β-catenin表达，且黄芩苷能够抑制LiCl所上调的Wnt信号通路的活性和γ-H2AX的蛋白表达水平。上述结果表明：黄芩苷能够通过抑制Wnt／β-catenin信号通路的活化，阻止缺血所导致心肌细胞的DNA氧化损伤。

此外，黄芩苷在成药方面具有两大优势：①黄芩苷在多种急慢性炎症的临床治疗中已经有运用，其安全性及有效性已经得到证实；②黄芩苷作为小分子化合物，成药方便，造价较低。基于我们的研究发现及黄芩苷的成药优势，我们认为：黄芩苷将有望成为临床上治疗AMI的有效药物。

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R285.5

1000-338X（2017）02-0031-03

2016-12-28

陈可冀中西医结合发展基金（CKJ2016005）；国家自然科学基金（81302884）。

邱丽满（1990—），女，硕士研究生，主要从事中西结合心血管疾病的基础研究。

彭军（1969—），男，研究员，医学博士，博士生导师。

E-mail：pjunlab@hotmail.com