猪传染性胃肠炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗体IgG检测

刘霞

（四川省内江市种猪场，四川内江641007）

猪传染性胃肠炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗体IgG检测

刘霞

（四川省内江市种猪场，四川内江641007）

本试验旨在对猪传染性胃肠炎核酸疫苗（含有TGEV-S基因质粒）开展免疫原性研究，为科学评价该TGE核酸疫苗的免疫效果提供依据。通过灌胃口服免疫TGE核酸疫苗诱导小鼠机体产生特异性免疫，定期采样监测其血清抗体产生规律，采用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体IgG的抗体效价。结果发现：TGE核酸疫苗免疫小鼠后有效地激发了TGEV特异性抗体，首免后第二周开始就能检测到血清抗体应答，且该组抗体水平一直都与空载体组和PBS空白对照组之间呈极显著差异（P＜0.01），表现出良好的免疫原性。

猪传染性胃肠炎；核酸疫苗；血清抗体IgG；间接ELISA

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以仔猪呕吐、腹泻和高致死率为主要特征的急性、高度接触性传染病[1-2]，是造成仔猪早期死亡的重要疫病之一[3-4]。TGE被世界动物卫生组织（OIE）确定为B类传染病，是我国法定检疫的疫病。TGEV属冠状病毒科冠状病毒属，是单股正链RNA病毒，主要编码4种结构蛋白：核蛋白（N），膜蛋白（M），纤突糖蛋白（S），小膜蛋白（sM）[5-6]。其中S蛋白对TGEV是非常重要的，是唯一能诱导机体产生中和抗体的结构蛋白，是基因工程研究的重点[7-8]。

目前研究表明，常规药物对TGE的治疗效果很不理想，疫苗接种是预防该病的有效方法[9-10]。针对TGEV肠道感染的特点，口服疫苗免疫是预防该病较为理想的途径[5]。近年来，在TGEV口服疫苗方面的研究表明，以减毒沙门氏菌为载体携带DNA疫苗进行口服免疫，被证实具有运送效率高，方法简单，免疫效果较好，安全性高，能同时激发全身免疫和局部黏膜免疫等优点，有着良好的应用前景。

正是基于TGEV的S蛋白在决定宿主的亲嗜性、致病性、血凝性方面起关键作用并且是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护的结构蛋白，同时针对TGEV肠道感染和减毒沙门氏菌的特点，本试验选用了以减毒沙门氏菌为载体的含TGEV S基因的核酸疫苗，结合病原TGEV的感染途径和发病机理，通过灌胃免疫昆明小鼠，采集血清，通过间接ELISA法检测小鼠血清抗体IgG的产生规律，以验证该核酸疫苗的免疫效果，为科学评价该TGE核酸疫苗提供科学依据，也为以后在猪场投入使用该疫苗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源TGE核酸疫苗（含S基因的重组减毒沙门氏菌），空载体（不含S基因的重组减毒沙门氏菌），由本单位实验室保存。

1.1.2 主要试剂HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗，购自北京博奥森生物有限公司；TMB底物反应液，购自北京天根生物有限公司；卡那霉素（Kan），购自美国AMERSCO公司；BSA等。

1.1.3 自配试剂PBS溶液：称取NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、KH2PO40.2 g/L、Na2HPO412.03 g/L，然后用1mol/L NaOH调节pH值至7.2，115℃高压下灭菌20min，室温下保存。

PBST洗涤液：在PBS溶液中加入0.1%吐温-20即得。

包被缓冲液：称取Na2CO31.59g和NaHCO32.93g，定容至1000mL后置室温下保存备用。

反应终止液（2mol/L H2SO4）：向60mL双蒸水中缓慢加入10.8mL浓硫酸，注意边滴加边搅拌，定容至100mL后置室温下保存备用。

1.1.4 实验动物6周龄雌性昆明小鼠，购自成都某生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫小鼠分组将体重为20g左右的6周龄雌性昆明小鼠随机分成3组（见表1），分别为TGE核酸疫苗组、空载体组、PBS对照组，每组16只小鼠。以每只小鼠1×109CFU/0.2mL灌胃免疫，免疫前禁食禁水4 h（使沙门氏菌得到充分免疫），免疫后1 h恢复正常饮食。一共免疫3次，每次间隔2周[11]。

表1 免疫小鼠分组

1.2.2 血清样品制备各免疫组分别在免疫前和首免后的2、4、6周随机捕杀4只昆明小鼠，摘眼采血[11]，血液置4℃下过夜以充分析出血清，然后4000 r/min离心5min收集血清，-20℃保存备用。

1.2.3 TGEV特异性血清抗体IgG的检测取免疫前和首免后2、4、6周所采集的血清进行间接ELISA检测，检测时注意尽量减少血清的反复冻融，检测的具体操作步骤如下：

（1）TGEV抗原包被：将表达纯化的TGEV Sbc蛋白和包被缓冲液按终浓度10μg/100μL混匀，然后按100μL/孔加入到96孔酶标板，4℃下包被过夜。

（2）BSA封闭：甩干包被缓冲液，按250μL/孔加入PBST洗涤液，然后置于振荡器上振荡3min，叩干。如此重复3次。再按100μL/孔加入封闭液（BSA），置于37℃恒温培养箱中封闭1h。

（3）加入待检血清：甩干封闭液，按250μL/孔加入PBST洗涤液，然后置于振荡器上振荡3min，叩干。如此重复3次。按100μL/孔加入50倍稀释的待检血清，置于37℃恒温培养箱中1h。

（4）加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗：取出后按250μL/孔加入PBST洗涤液，然后置于振荡器上振荡3min，叩干。如此重复3次。按100μL/孔加入5000倍稀释的酶标二抗，然后置于37℃恒温培养箱中1h。

（5）加入底物反应液：取出后按250μL/孔加入PBST洗涤液，置于振荡器上振荡3min，叩干。如此重复3次。按100μL/孔加入底物反应液（TMB），置于37℃恒温培养箱中避光显色15min。

（6）加入终止反应液：取出后按100μL/孔加入终止反应液以终止反应。

（7）读数：终止反应后，使用ELISA酶标仪于波长450nm下测定OD450值。

1.2.4 数据处理应用SPSS17.0软件对所测得的OD450值进行差异显著性检验，数据用平均数±标准差（X±SEM）表示。

表2 免疫小鼠抗TGEV血清IgG抗体的间接ELISA检测结果

图1 免疫小鼠抗TGEV血清IgG抗体的间接ELISA检测

2 结果与分析

免疫小鼠血清特异性IgG抗体检测结果见表2、图1。由表2可得，免疫前各组血清特异性IgG抗体水平都较低，组间差异不显著（P＞0.05）；免疫后第2周，TGEV核酸疫苗组（含S基因）的抗体OD450值分别比空载体组和PBS对照组高0.081和0.097，且TGEV核酸疫苗组（含S基因）与空载体组、PBS组之间差异达到极显著水平（P＜0.01），但空载体组和PBS组之间差异不显著（P＞0.05），说明TGEV核酸疫苗组（含S基因）在小鼠体内成功地释放了所携带的TGEV S基因，激发小鼠机体产生特异性TEGV IgG血清抗体；免疫后第4周和第6周，TGEV核酸疫苗组（含S基因）的血清特异性IgG抗体水平与空载体组、PBS组的差异进一步扩大，均达到极显著水平（P＜0.01），且空载体组和PBS组之间差异也极显著（P＜0.01）。

图1显示，在整个试验过程中，随着免疫次数的增加，TGEV核酸疫苗组（含S基因）的血清特异性抗体IgG水平持续上升，其中0～4周上升幅度较大，4～6周上升幅度较小；空载体组的血清抗体IgG水平在0～4周也有较大提高，但增幅明显较TGE核酸疫苗组（含S基因）低，且三免后两周略有下降；PBS组的血清特异性抗体IgG水平有升有降，但始终维持在较低的水平。

3 分析

核酸疫苗是20世纪90年代诞生的基因工程重组疫苗，因其制备工艺简单，能有效激发全面的免疫应答，便于制备多价与多联疫苗，使用安全而被广泛应用于多种疫病的疫苗研究中，并取得了良好的试验效果。猪传染性胃肠炎（TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒引起的一种消化道传染病，其中2周龄以内的仔猪死亡率高达100%[12-14]。该病在我国许多地方猪场均有发生，近年来有扩大流行的趋势，也是世界各国引起仔猪早期死亡的重要疫病之一。目前的研究表明药物对TGE的治疗效果不明显，对该病只能采取“疫苗预防为主，药物治疗为辅”的方针。因此，TGE核酸疫苗的研究与开发一直是近年来该病的研究重点。随着对病原的深入研究，发现TGEV的S蛋白含有宿主细胞氨肽酶（pAPN）的识别位点，在病毒感染、发挥致病性和决定宿主细胞亲嗜性等方面起关键作用，而且S蛋白携带的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体与提供免疫保护作用的结构蛋白。因此S蛋白是TGE疫苗研究的重点。

本试验选择了以减毒沙门氏菌作为载体的含TGEV-S基因的核酸疫苗，灌胃免疫昆明小鼠，在首免后第2周就能检测到特异性血清抗体应答，且该组抗体IgG水平一直都与空载体组和PBS空白对照组之间呈极显著差异（P＜0.01），表现出良好的免疫原性，有效地激发了TGEV特异性血清抗体。

4 结论

本试验采用灌胃免疫昆明小鼠并定期采集血清，通过间接ELISA方法摸清了血清特异性IgG抗体产生的规律。结果表明：TGE核酸疫苗成功地激发了小鼠机体内的体液免疫应答，产生了TGEV特异性抗体，表现出了良好的免疫原性，一定程度上说明该TGE核酸疫苗效果良好，可适当在猪场投入使用。

[1]杨恒，曹三杰，黄小波，等.TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX-S-N的构建及体外表达[J].中国兽医学报，2009，29（3）：254-257.

[2]曹军平，朱爱萍，肖作焕，等.猪传染性胃肠炎的诊断与防制[J].中国动物检疫，2000（6）：29.

[3]冉智光，王玉春.猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究新进展[J].天津畜牧兽医，1998，15（4）：4-6.

[4]斯特劳B E.猪病学[M].赵德明，张中秋，沈建忠，译.北京：中国农业大学出版社，2000.

[5]Krempl C，Schultze B，Laude H，et al.Point mutations in the S protein connect the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus[J].J Virol，1997，71（4）：3285-3287.

[6]Jimenez G，Correa L，Melgosa M P，et al.Critical epitopes in transmissible gastroenteritis virus neutralization[J].J Virol，1986，60（1）：131-139.

[7]姜骞.猪传染性胃肠炎检测试剂的研制及快速诊断方法的研究[D].哈尔滨：东北农业大学硕士学位论文，2003.

[8]杨乐乐.猪传染性胃肠炎病毒S基因表达的研究及其原核表达产物的生物学活性分析[D].武汉：华中农业大学硕士学位论文，2005.

[9]任玲，李广兴，张宏伟.猪传染性胃肠炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠体液免疫功能变化的研究[J].畜牧兽医杂志，2007，26（5）：16-18.

[10]胡延春，郑传廷，王妍，等.现代科技对动物疫病防控的推动作用[J].中国畜牧兽医文摘，2009（6）：38-40.

[11]师东方，李一经，唐丽杰，等.猪传染性胃肠炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗体应答[J].中国兽医科技，2003，33（8）：31-34.

[12]Enjuanes L，Sune C，Gebauer F，et al.Antigen selection and presentation to protect against trans missible gastroenteritis coronavirus[J].Veterinary Micro Biology，1992，33（1-4）：249-262.

[13]Hooper B E，Haelterman E O.Concepts of the pathogenesis and passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine[J].J Am Vet Med Assoc，1966，149：1580-1586.

[14]王树成，赵祥平.猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究[J].中国畜禽传染病，1998，20（1）：21-22.

Detection of the Serum IgG Antibody in M ice A fter Being Immunized w ith TGE Nucleic Acid Vaccine

Liu Xia
（Pig Breeding Farm of Neijiang City，Sichuan Neijiang 641007，China）

In order to provide theoretical basis for scientific evaluation，this experiment was conducted to study the immunogenicity of the TGE nucleic acid vaccine，carring S gene of TGEV.To induce specific immunity，the female Kunming mice were orally immunized with the TGE nucleic acid vaccine.The samples of serum were collected every two weeks within 1～6 weeks after being immunized and detected for specific IgG antibody titer by the indirect ELISA.The results showed that TGE nucleic acid vaccine could induce high titer antibody，the specific IgG antibody was induced starting from the second week after the first immunization，the IgG antibody of TGE nucleic acid vaccine，carring S gene of TGEV in the experimental group was higher than that of the latter two control groups and distinguished significantly（P＜0.01），and showed good immunogenicity.

TGE；Nucleic acid vaccine；Serum IgG antibody；Indirect ELISA

S852.43

B

1001-8964（2017）05-0027-04

2017-03-01

刘霞（1986-），女,四川隆昌人，农学学士，助理兽医师，主要从事内江猪保种相关工作。