高大环柄菇菌株的鉴定及生物学特性

潘雪娇　曲晓华　刘宇　王守现

摘要：以1株大环柄菇属野生菌为研究对象，依据形态学和分子生物学特征鉴定为高大环柄菇。通过测定菌丝生长速度、菌丝体干质量和生长势等指标，研究其生物学特性。结果表明，该菌菌丝生长的最适碳源为淀粉，最适氮源为大豆蛋白胨；菌丝生长适宜的碳氮比为（10～30）：1，最适碳氮比为20：1；最适生长因子为维生素B₁；菌丝生长适宜温度为24～28℃，最适温度为28℃；最适pH值为7.0。

关键词：高大环柄菇；鉴定；组织分离；碳氮比；生长因子；生物学特性

中图分类号：S646.01 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0199—03

高大环柄菇（Macrolepiota procera）别称高脚环柄菇、高柄环菇、棉花菇等，国外别称阳伞蘑菇，在分类上属于真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目蘑菇科大环柄菇属。夏秋季节于林中地上或草地上单生至散生、稀群生一起，是主要分布于亚热带地区的一种大型腐生菌，也是一种土生的食用菌。子实体一般大型，菇柄粗长；质地脆嫩，风味宜人，食味较美，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素及矿物质等，尤以人体必需氨基酸含量高而著称，是一种很有开发前景的食用菌新品种。目前，国内外关于高大环柄菇的人工栽培已有相关报道，Boyer研究发现可用双孢菇堆肥进行人工栽培，丁智权等也报道了其栽培技术，但关于高大环柄菇的大面积推广应用仍未见报道，究其原因为当前对该菌的研究不深人、缺乏基础数据来支撑其配套栽培技术。因此，为更好地开发利用这一野生菌，笔者在前人研究的基础上，采用菌丝生长速度、菌丝体干质量和生长势等指标对1株野生高大环柄菇的生物学特性进行研究，筛选出最佳的生长条件，为其人工栽培及推广应用提供技术支撑。

1材料与方法

1.2野生菌母种分离

2014年8月25日在吉林省白河林业局黄松蒲林场采集一种大环柄菇属真菌，组织分离获得该野生菌的母种。

1.3野生菌株鉴定

1.3.1形态学鉴定 肉眼观测野生子实体的外表形态以及周围生境。观察菌丝体在固体培养基上菌落的形状、大小、颜色、味道、生活力等。光学显微镜观测担孢子形态，并采用平板斜插盖玻片法观测菌丝锁状联合结构、细胞大小、形态等。

1.3.2分子鉴定 利用ITS1和ITS4通用引物对分离的野生菌株进行ITS-PCR鉴定。

1.4野生高大环柄菇的生物学特性研究

碳源、氮源、碳氮比、生长因子、温度、pH值等试验参照文献[7—9]中的方法。

1.5测定方法

1.5.1菌丝的平均生长速度 将黄伞菌种接种于平板培养基表面的中央，培养8 d后测量菌落半径，以菌落平均半径除以时间即为菌丝的日平均生长速度。

1.5.2菌丝干质量 将测定完生长速度的平皿放人高压锅内121℃加热至培养基融化（10 min），趁热将菌丝取出置于单层纱布上，热水浴1 h，然后置于烘干箱内105℃烘干至恒质量，称量。

1.5.3生长势的测定 菌丝生长浓密、长势旺盛，用“+++-4-”表示；菌丝生长较密、长势较好，用“+++”表示；菌丝生长密、长势一般，用“++”表示；菌丝生长稀、长势较弱，用“+”表示；菌丝不生长，用“-”表示。

2结果与分析

2.1野生菌株的鉴定结果

2.1.1形态学鉴定结果 子实体（图1）一般大型，菌盖直径17～30 cm，中部褐色，有锈褐色鳞片；菌肉白色，较厚；菌褶白色，较密，离生，不等长；菌柄长15～38 cm，粗0.6～2.0 cm，柱形，向下渐粗，褐色，略扭转，基部膨大，有可移动菌环；孢子印白色，孢子无色，光滑，卵圆形，（13～18）μm×（10～12）μm。

2.1.2分子鉴定结果 利用ITSl和ITS4通用引物对野生菌株进行扩增、测序。对测序结果进行BTJAST比对，发现目标序列与登录号为HMl25514.1的高大环柄菇菌株同源性达到99.85%。因此，结合子实体形态可确定分离菌株为高大环柄菇。野生高大环柄菇菌株的ITS序列为：5′-TTTGAGGTCAATTTTCAGTATAATrGTCCATGAAGACTGGACGATTGGCAGCTGAACAGACAGAGAGCGACCACACGGCGTAGATAATTATCACACCTGTGACGGATCGCAAACGGTTCCGCTAATGCATTTCAGAGTAGCTGACCTTTAAAAGGCCAGCAAACCTCCATATCCAAGCCCCATCACAGAAAACTGGAGGGGTTGAGAATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAGATCATTTATAGGCACAAAGGCCCATTGAATACATTCTACAACATACTATGTGGTATATGAAAACATAGACTCCAGGGAAGGTTCACAACCATTTGAGGAGAGCTGCACTTTTTTTTTTGCGCAAGCATTCCTCACATCCGAGAAGACTCGATAGGTGGCTGCTCTCAATCCCTAGAAGACTACAAAAGGTGCACAGGTGGATGAATAAAAAACAAGACAGGTGTGCACAATGCCCCGGAGAGCCAGCTACAACCCATCAAGTATATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAA-3′。

2.2野生高大環柄菇的生物特性试验结果

2.2.1碳源对高大环柄菇菌丝生长的影响 试验结果（表1）表明，高大环柄菇菌株对供试碳源都能利用，但不同碳源问高大环柄菇菌丝生长速度、菌丝体干质量和长势差异显著。其中，该菌株在对照培养基和以淀粉、蔗糖和山梨醇为碳源的培养基上日生长速度较快，但差异不显著；在以淀粉为碳源的培养基上，菌丝生长势旺盛，干质量最高，达0.038 8 g，且与其他3种碳源差异显著。因此，本试验选取的最佳碳源为淀粉。

2.2.2氮源对高大环柄菇菌丝生长的影响 试验结果（表2）表明，高大环柄菇菌株在不同氮源培养基上的生长速度差异显著。菌丝生长速度以大豆蛋白胨最快；其次是酵母浸粉；最慢的是对照。从菌丝干质量来看，牛肉浸膏最高；其次是大豆蛋白胨；大豆粉最差。从菌丝生长势来看，以大豆蛋白胨为氮源的菌丝浓密，长势最佳；其次为酵母浸粉；大豆粉和对照最差。因此，本试验选用大豆蛋白胨作为最佳氮源。

2.2.3碳氮比对高大环柄菇菌丝生长的影响 由表3可以看出，不同碳氮比对高大环柄菇菌丝生长影响明显。高大环柄菇菌丝在碳氮比为（10～60）：1范围内均可生长，但以（10～30）：1生长较适宜，在此之间菌丝生长速度较快且差异不显著。碳氮比在（50～60）：1之间，菌丝生长缓慢。从菌丝干质量来看，碳氮比为10：1时，菌丝干质量较高但与碳氮比为20：1的培养基差异不显著；碳氮比在（50～60）：1之间，菌丝干质量最差。因此，本试验选用碳氮比为20：1。

2.2.4生长因子对高大环柄菇菌丝生长的影响 试验结果（表4）表明，不同生长因子对高大环柄菇菌丝生长存在一定的影响，其中维生素B₁、维生素B₂和肌醇的菌丝生长速度最快，且三者之间差异不显著；维生素C最差。从菌丝干质量来看，维生素B₂、肌醇、维生素B₁和玉米浆的菌丝体干质量较高，且四者问差异不显著；维生素C最低。因此，本试验选维生素B₁作为最佳生长因子。

2.2.5温度对高大环柄菇菌丝生长的影响 试验结果（表5、图2）表明，不同温度处理对高大环柄菇菌株生长速度具有显著的影响。在16～32℃之间菌丝均能正常生长，但24～28℃最适宜，其中在28℃时菌丝生长速度、菌丝体干质量、生长势均较优；当温度低于24℃时，虽然菌丝仍然洁白稠密，但生长速度减慢；当温度达到36℃时，菌丝完全停止生长。因此，本试验选取的最适培养温度为28℃。

2.2.6 pH值对高大环柄菇菌丝生长的影响 从表6可以看出，高大环柄菇菌丝在pH值为5.0～8.5之间均能生长；当pH值大于8.5时，高大环柄菇菌丝不能生长。在pH值为5.0、7.0时，菌丝生长较快，且差异不显著。从菌丝体干质量来看，pH值为5.0、6.0时，菌丝体干质量较高，且两者之间差异不显著。从菌丝生长势来看，当pH值为7.0时，菌丝长势最旺；其次是pH值为5.0、6.5；菌丝在pH值为8.0～8.5之间时长势较弱；当pH值为9.0时，菌丝不能生长。因此，本试验选取的最适pH值为7.0。

3结论与讨论

在欧洲、亚洲和非洲的许多国家和地区，高大环柄菇是很名贵的菌类，该菌不但适于鲜销，还适于制罐或制干，因菇柄粗且长，干物质含量高，是很好的加工原料，具有很高的推广价值。目前，关于大型真菌的生物学特性的研究报道较多，但多数以菌丝生长速度和生长势作为衡量指标，筛选其最适生长条件。菌丝干质量是指菌株利用碳源、氮源等营养成分，合成自身结构物質烘干后的质量；在一定程度上可以反映菌株利用营养成分的强弱，作为菌株健壮程度的评价标准。本研究采用菌丝日生长速度、菌丝体干质量和菌丝生长势等指标对野生高大环柄菇菌株的生物学特性进行综合分析评价，结果表明，该菌适合的碳源选择比较广，在以淀粉、蔗糖和山梨醇为碳源的培养基上菌丝生长速度、菌丝干质量及生长势都比较好，该结果与冯飞等报道的一种大环柄菇属（Macrolepiota sp.）真菌的最适碳源一致，结合菌丝干质量，选择淀粉为最适碳源；在氮源利用方面，该菌对氮源的选择比较窄，最适氮源为大豆蛋白胨，这与荷叶离褶伞、黄伞菌株的最适碳源一致；适宜的碳氮比为（10～30）：1，最适碳氮比为20：1；最适生长因子为维生素B₁，这与冯飞等报道的结论一致；高大环柄菇菌丝体生长适宜的温度范围为24～28℃，最适温度为28℃，这与冯飞等报道的最适温度为25℃不一致，主要可能是因为试验所采用的培养箱精密度不一样，笔者近年来研究发现多数食用菌的最适生长温度为28℃；最适pH值为7.0，该结论与丁智权报道的最适pH值为6.5～7.2相吻合。目前，未见其他关于高大环柄菇最适氮源、碳源、碳氮比及最适生长因子的综合研究报道，本研究结果可为高大环柄菇的人工栽培及推广应用提供一定的依据。