探讨食品检验中乳酸菌的鉴定方法
2017-05-17
据《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》标准所示,乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)主要有乳杆菌、链球菌以及双歧杆菌三种菌属,并在食品、药品中广泛存在。为响应国家对食品安全的监管,本文特从不同角度鉴定食品中的乳酸菌菌种水平,详细研究过程如下:
资料与方法
一般资料。本次研究所有菌种均采自某市微生物菌种保藏中心,共计15株。其中乳酸杆菌6株,双歧杆菌7株,链球菌2株。
鉴定仪器:(1)API鉴定系统、API 50 CHL板条、API 20A 板条(生产厂家:法國生物梅里埃公司);(2)RP耗材样品制备包(生产厂家:美国杜邦公司);(3)生化管(生产厂家:杭州滨和微生物);(4)Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统(生产厂家:美国Dupont公司);(5)Quantity One紫外成像仪、电泳仪(生产厂家:美国BioRad公司);(6)Veritii PCR扩增仪(生产厂家:美国ABI公司),体积为50μL[2]。
鉴定试剂:(1)细菌基因组DNA提取试剂盒(生产厂家:北京天根生物);(2)DNA Marker、PCR缓冲体系(缓冲液5μL,含MgCl2)以及rTaqDNA聚合酶(生产厂家:大连宝生物工程有限公司)0.25μL;(3)正向引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)、反向引物1492R(5-TACGGCTACCTGTTACTT-3)各200pmol/L。
鉴定方法。染色镜检:根据《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中乳酸菌的生化反应指标,筛选单菌落革兰染色镜检。根据《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》检验双歧杆菌。
API鉴定:乳酸杆菌由API 50 CHL板条进行鉴定,双歧杆菌由API 20A 板条进行鉴定。
分析法鉴定:(1)16S rRNA基因序列分析法鉴定:由DNA提取试剂盒提取单菌落细菌基因组DNA,100℃热盖,95℃持续变性1min,56℃退火30s,72℃延伸90s,PCR循环共30个;72℃延伸10min;采用1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物,利用紫外凝胶成像分析仪观察电泳结果,然后通过Clustalw软件对测序结果加以分析,并通过GenBank数据库行BLAST对比。(2)RiboPrinter指纹图谱分析法鉴定:将单菌落悬浮于缓冲液内,并作95℃处理,随即加入裂解液A、B 5μL,然后采用Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统进行鉴定。
结果
染色镜检。鉴定结果显示,1株乳酸杆菌和1株链球菌的生化反应不符合《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》标准,但5株乳酸杆菌和1株链球菌的生化反应符合标准。6株双歧杆菌的生化反应不符合标准,仅1例完全符合。如图所示,所有菌株均为革兰阳性菌,无芽孢。
API鉴定。4株乳杆菌鉴定结果显示“类干酪乳杆菌干酪亚种”,未达到“种”水平。2株双歧杆菌鉴定结果显示“内放线菌”,未达到“属”水平;4株双歧杆菌鉴定结果显示“双歧杆菌1”,未达到“种”水平。2株乳杆菌、2株链球菌以及1株双歧杆菌鉴定结果均达到“种”水平。
分析法鉴定。16S rRNA基因序列分析法鉴定:15株中12株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平,但3例未达到。RiboPrinter指纹图谱分析法鉴定:15株中11株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平,3例未达到,1例未能鉴定。
讨论
《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》指出,菌株不同,其生理生化特征存在明显差异,因此本文结果显示6株双歧杆菌的生化反应不符合标准,且API鉴定结果显示15株中10株仅达到“属”水平。
而分析法鉴定结果相对理想,比如16S rRNA基因序列分析法和RiboPrinter指纹图谱分析法通过PCR对DNA片段加以选择,不受培养条件限制,其鉴定结果如本文所示:15株中11株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平。综合以上三种鉴定方法可知,参照《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》与《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》的染色镜检虽具有一定乳杆菌、链球菌的鉴定能力,但双歧杆菌的鉴定水平不足;而API对三种菌属的鉴定能力基本一致,但整体水平相对较弱,无法达到“种”水平;相较以上两种方法,分析法鉴定既符合国家标准,同时又对API鉴定进行了有效补充。
综上所述,在食品检验中,分析法鉴定水平最高,为食品安全提供有力保障,值得大力推广。