二脒那秦在肺动脉高压模型大鼠中的预防和治疗作用

周 康， 殷 音， 彭 毅， 杨 徐

(石河子大学医学院第一附属医院心内科，石河子，新疆 832000)

研究报告

二脒那秦在肺动脉高压模型大鼠中的预防和治疗作用

周 康， 殷 音， 彭 毅， 杨 徐

(石河子大学医学院第一附属医院心内科，石河子，新疆 832000)

目的 探究二脒那秦(DIZE)对肺动脉高压(PAH)模型大鼠的预防及治疗作用。方法 采用左肺叶切除联合野百合碱(MCT)腹壁皮下注射建立PAH大鼠模型，100只成年雄性Wistar大鼠随机分成空白对照组(A组)、DIZE对照组(B组)、PAH模型组(C组)、DIZE处理PAH模型组(D组)和(DIZE+C-16)处理PAH模型组(E组)，利用活性荧光共振能量转移(FRET)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血管紧张素转化酶2(ACE2)、血清IL-6及IL-8水平，并测定平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥厚指数(RVHI)，计算中膜厚度与肺动脉外径的比例(WT)、内膜增生评分，并通过弹力纤维染色分析肺血管病变。结果 RVHI、ACE2酶活性、WT及内膜增生评分比较：与A组比较，C组、D组和E组差异有统计学意义(P<0.05)；D组和E组差异有统计学意义(P<0.05)。五个组在各个指标整体分析中差异有统计学意义(P<0.05)。结论 二脒那秦可以提高ACE2酶活性，并有效降低mPAP、RVHI和WT，同时减轻肺动脉中膜肥厚，并抑制肺小动脉内膜增生。该研究结论为二脒那秦治疗人类PAH提供实验基础。

二脒那秦；野百合碱；肺动脉高压；大鼠

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一组由异源性疾病和不同发病机制引起的以肺血管阻力持续增高为特征的临床病理生理综合征。其主要特征为肺动脉阻塞引起肺血管阻力及肺动脉压力渐进性升高，伴随不可逆的肺血管重构，最终导致右心衰竭而死亡[1]。目前虽发现钙通道阻滞剂、前列腺素类、内皮素受体拮抗剂、特定种类干细胞等具有舒张血管功能药物及细胞，可以缓解或治疗高血压病[2-5]，但对高发病率、高死亡率的PAH却效果较差，急需寻找一种新的药物来提高疗效。二脒那秦是以对硝基苯甲酸、对甲苯磺酰胺为原料经复杂化学反应合成的化学试剂，曾一直用来治疗大型家畜的焦虫和锥虫病；血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)通过形成舒血管物质可以对血压、心脏、肾脏、呼吸及其他系统进行调解，是心血管功能重要的调节器[6]。有研究指出两者之间存在关系，即二脒那秦作为ACE2的激活剂，在改善高血压方面具有重要的作用[7]。为探讨二脒那秦对ACE2的作用及对高血压预防及治疗效果，本研究利用二脒那秦在肺动脉模型大鼠中进行实验研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

动物：健康成年雄性Wistar 大鼠100只，体质量(190～210)g，平均(198.6±2.6)g，由石河子大学实验动物中心提供，动物生产许可证号： SCXK(新)2011-0001；动物使用许可证号： SYXK(新)2011-0003；新疆省医学实验动物中心伦理委员会批准文号：20141022-015。

试剂：MCT由Sigma公司生产；二脒那秦购自济南伟都化工有限公司；Trizol试剂由Vitrogen Life公司生产；ACE2抑制剂(C-16)购自Cayman Chemical；Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH和赖诺普利由美国RD System公司生产；IL-6和IL-8 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒由石河子大学实验动物中心提供；其余试剂为分析纯。

1.2 显微镜和摄像系统及图片分析测量软件信息

光学显微镜及摄像系统来自日本Nikon公司，型号HB-10101AF；Medlab-E生物信号系统设备来自南京美易科技有限公司；生物机能实验系统来自成都泰盟科技有限公司，型号BL-420E；Image-proplus 6.0图像分析系统来自美国Media Cybemeties公司。

1.3 动物分组及模型建立

分组：将100只Wistar大鼠随机分为5组，每组20只：空白对照组(A组)、DIZE对照组(B组)、PAH模型组(C组)、DIZE处理PAH模型组(D组)和(DIZE+C-16)处理PAH模型组(E组)。除A组B组外，均按下法建立PAH模型。

各组实验：正常对照组对Wistar大鼠腹壁皮下注射等量生理盐水，并给予生理盐水灌胃5 mL/d；DIZE对照组对Wistar 大鼠腹壁皮下注射等量生理盐水，并给予二脒那秦灌胃0.25 mg/kg·d；PAH模型组对PAH大鼠给予生理盐水灌胃5 mL/d；DIZE处理PAH模型组对PAH大鼠予以二脒那秦灌胃0.5 mg/kg·d；(DIZE+C-16)处理PAH模型组对PAH大鼠予以二脒那秦灌胃0.5 mg/kg·d，C-16溶于生理盐水，浓度为20 μg/mL，加入容积为200 μL的微渗透泵，植入背部皮下，以0.25 mL/h(100 μg/d)的速度持续皮下注射。所有各组均连续28 d到达实验终点。

1.4 血流动力学指标和右心肥厚指数测定

参照刘杰等[9]方法，将10 cm 长硬膜外导管末端1～1.5 cm 加热拉伸，并使其弯曲成鱼钩状，用注射器注水成功表示肺动脉导管通畅。到达实验终点后将大鼠取出，12%乌拉坦(剂量为 8 mL/kg)对大鼠行腹腔注射，麻醉后将大鼠固定于手术台上，术中持续面罩给氧。分离大鼠右侧颈外静脉，将充满肝素盐水的右心导管后插入，一端连接换能器另一端与监护仪相连，当置入导管进入右心室稳定后记录其右室收缩压 (RVSP)，监护仪出现肺动脉波形时，待其稳定后记录平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)。高钾注射处死大鼠，剪开胸腔取出心肺，用20 mL注射器收集大鼠全血并分离右室(RV)和左室加室间隔(LV+S)盐水洗净，滤纸抽干后称重，将(RV)/(LV+S)作为右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。

1.5 血清IL-6、IL-8水平检测

将到达实验终点处死后收集到的大鼠全血4℃下静置60 min，收集血清。按照ELISA法参照试剂盒说明利用酶标仪检测血清中IL-6、IL-8水平。

1.6 肺组织ACE2酶活性检测

参照谭宇等[10]采用活性荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法检测ACE2酶活性。利用ACE2可以水解荧光肽底物Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH产生两个荧光发色基团，在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)的原理，将到达实验终点处死后收集到的大鼠肺组织匀浆，按照1∶10比例稀释，50 μg/L浓度加入赖诺普利阻断ACE2的作用，45 μL匀浆液与10 μmol荧光底物充分混合后，采用激光诱导荧光检测器(美国TriSep-2100型)，以310 nm(激发波长)和420 nm(发射波长)进行检测。

1.7 肺组织病理学观察

收集获得的肺组织用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片Verhoeff-铁苏木素染色，参照吴思婧等[11]人的操作步骤，利用Image-proplus 6.0图像分析系统观察肺动脉的病变情况。没有内膜增生记0分、内膜增生<50%记1分，>50%记2分；100～200 μm肺动脉以中膜肥厚为主要的病理改变，计算中膜厚度与肺动脉外径的比例 (wall thickness, WT%)。分析比较增生程度的差异。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 二脒那秦对肺组织ACE2酶活性的影响

肺组织ACE2酶活性比较结果：经单因素方差分析，5个组整体分析差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合主要数据来看：与A组比，B组差异无统计学意义(P>0.05)，C组、E组显著降低(P<0.05)，D组显著升高(P<0.05)；与D组、E组比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

2.2 二脒那秦对mPAP和RVHI的影响

血液动力学和RVHI比较结果：方差分析显示，5个组整体分析差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合数据来看：与A组比，B组差异无统计学意义(P>0.05)；C组、D组和E组差异有统计学意义(P<0.05)；与D组比，E组差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

2.3 二脒那秦对中膜肥厚和内膜增生的影响

5个组整体分析差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较：与A组WT及内膜增生评分比，B组差异无统计学意义(P>0.05)，C组、D组和E组增加明显，差异有统计学意义(P<0.05)；与D组比，E组评分明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

显微镜下染色切片结果显示C组、E组大鼠肺小动脉外侧弹力纤维间距明显增宽，管壁厚度增加，表现为中膜肥厚；C组、E组大鼠肺小动脉内弹力纤维被破坏，内层管壁厚度增加，内膜增生分数值增加；D组内膜增生分数值较C组、E组下降，见图1。

2.4 二脒那秦对血清中IL-6、IL-8水平的影响

血清中IL-6、IL-8水平比较结果：5个组整体分析差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较并结合主要数据来看：与A组比较，B组、D组差异无统计学意义(P>0.05)，C组、E组差异有统计学意义(P<0.05)；与D组比，E组差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4。

表1 二脒那秦对肺组织ACE2酶活性的影响

注：RFU表示相对荧光单位。与A组比较，*P<0.05；与D组比较，#P<0.05

Note. RFU represents the relative fluorescence units. Compared with group A,*P<0.05; compared with group D,#P<0.05

表2 二脒那秦对mPAP和RVHI的影响

注：与A组比较，*P<0.05；与D组比较，#P<0.05

Note. Compared with group A,*P<0.05; compared with group D,#P<0.05.

表3 二脒那秦对WT及内膜增生评分的影响

注：与A组比较，*P<0.05；与D组比较，#P<0.05

Note. Compared with the group A,*P<0.05; compared with the group D,#P<0.05.

表4 二脒那秦对血清中IL-6、IL-8水平的影响

注：与A组比较，*P<0.05；与D组比较，#P<0.05

Note. Compared with the group A,*P<0.05; compared with the group D,#P<0.05.

注：PAH大鼠100～200 μm直径肺动脉主要表现为中膜肥厚，50～100 μm直径肺动脉主要表现为内膜增生；C组表现为中膜肥厚和内膜增生；D组二脒那秦灌注后中膜肥厚和内膜增生明显减轻；E组C-16注射后，表现和C组类似。图1 不同组别大鼠动脉中膜肥厚及内膜增生情况(标尺=100 μm)Note. The pulmonary arteries in diameter of 100-200 μm showed mainly media hypertrophy. The pulmonary arteries in diameter of 50-100 μm showed mainly intimal hyperplasia in the PAH rats. The group C showed media thickening and intimal hyperplasia, and the medial thickening and intimal hyperplasia were significantly alleviated in the group D after perfusion of diminazene. After injected with C-16, the performance of group E was similar to that of group C.Fig.1 The thickening of arterial media and intima hyperplasia of rats in different groups (Bar=100 μm).

3 讨论

肺动脉高压是由心、肺或肺血管本身疾病等多种原因引起的一种病理生理状态，临床表现为肺动脉压异常升高。最新血流动力学诊断标准为：在海平面、静息状态下，右心导管测量平均动脉压≥25 mmHg[12,13]。野百合碱诱导大鼠PAH制备PAH动物模型已成为研究的常用方法。其主要原理可能是MCT自身并无生物活性，经吸收入血后，在肝脏代谢成为含五元杂环的吡咯野百合碱具有生物活性，吡咯野百合碱随血流经过肺时损伤肺血管内皮细胞，使血管屏障功能受损。血液中弹性蛋白酶、凝血酶等蛋自酶外渗，触发单核细胞等炎症细胞在受累动脉周围浸润，继发平滑肌细胞增生等肺血管重构件改变[14]。

本研究为探讨二脒那秦对PAH的作用机制，利用MCT制备大鼠PAH模型，选择0.25 mg/kg·d的二脒那秦用量，探讨对PAH大鼠模型的作用机制。研究结果显示，C组、D组和E组在肺组织ACE2酶活性方面有不同，D组加入二脒那秦与C组比较ACE2酶活性提高，而加入C-16(一种ACE2抑制剂)后ACE2酶活性降低，表明二脒那秦在一定程度上可提高ACE2的活性。此外，与D组比较，E组在肺组织ACE2酶活性、血液动力学、RVHI、WT、内膜增生评分方面有统计学差异 (P<0.05)，表明ACE2表达量的增加可以降低mPAP、RVHI和WT，同时减轻肺动脉中膜肥厚，并抑制肺小动脉内膜增生。ACE2是一种锌依赖性金属蛋白酶。它可降解 Ang II羧基端的苯丙氨酸，生成 Ang-(1-7)，同时也可降解 Ang I 的羧基末端，转化成 Ang-(1-9)。Ang-(1-7)、Ang-(1-9)参与血管张力的调节，还通过抑制平滑肌细胞增殖和迁移，降低肺动脉压力。ACE2是心血管方面重要的调节器，在人体心脏、肾脏、肺脏、睾丸、胃肠、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、子宫内膜、胰腺和卵巢等处均有表达[15]。有研究结果表明PAH模型中ACE2 酶活性水平的降低与肺血管平滑肌细胞过度增生和迁移增加有关[16]。当肺过度表达ACE2或使用ACE2激活剂激活ACE2过表达时，不仅能抑制血管壁增厚，还能减弱血管肌化程度，从而改善PAH中的肺血管重构。龚晶婧等[17]将重组ACE2的慢病毒与平滑肌细胞共培养，发现ACE2能通过下调AT1受体的表达，通过抑制STAT3磷酸化从而抑制平滑肌细胞增生。以上研究均表明ACE2在调节PAH方面的重要作用。

本研究结果显示:与A组血清中IL-6、IL-8水平比较，B组、D组无统计学意义(P>0.05)；C组、E组差异显著，有统计学意义(P<0.05)。与D组血清中IL-6、IL-8水平比较，E组差异显著，有统计学意义(P<0.05)。研究结果表明使用二脒那秦后，PAH大鼠模型IL-6、IL-8炎性细胞因子的表达量下降。多数研究结果证实PAH的发生涉及细胞、体液介质和分子遗传等多个方面[18]。PAH触发单核细胞等炎症细胞在受累动脉周围浸润，继发平滑肌细胞增生等肺血管重构件改变。而缺氧、自身免疫性抗体、病原微生物等多种因素可以导致促炎症因子表达升高，激活炎症细胞和下游的信号传导通路启动增殖过程和炎性病变。研究发现PAH患者丛样肺血管病灶中有巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，炎症在PAH发病中起重要作用[19]，但PAH中IL-8标志物水平变化未见报道。大鼠炎性细胞因子的分泌降低，炎症细胞和下游的信号传导通路启动增殖过程和炎性病变受到抑制，对治疗PAH大鼠肺血管方面意义重大。本研究结论与相关报道结论类似，表明IL-6、IL-8炎性细胞因子表达水平的下降与PAH治疗有重要关系[20]。

综上所述，使用二脒那秦可以提高ACE2酶活性，并有效降低mPAP、RVHI和WT，同时减轻肺动脉中膜肥厚，并抑制肺小动脉内膜增生。本研究为化学药物治疗人类PAH提供了一种思路。

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Preventive and therapeutic effect of diminazene in the rat model of pulmonary arterial hypertension

ZHOU Kang, YIN Yin, PENG Yi, YANG Xu

(Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi, Xinjiang 832000, China)

Objective To explore the preventive and therapeutic effects of diminazene (DIZE) on pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats. Methods Left pulmonary lobectomy combined with injection of monocrotaline was used to establish a rat model of pulmonary arterial hypertension. One hundred adult male Wistar rats were randomly divided into blank control group (group A, n=20), DIZE control group (group B, n=20), PAH model group (group C, n=20), PAH model plus DIZE group (group D, n=20) and PAH model plus DIZE and C-16 group (group E, n=20). Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), IL-6 and IL-8 levels were determined by fluorescence resonance energy transfer (FRET) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the mean pulmonary arterial pressure (mPAP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were measured. The wall thickness (WT) and intimal hyperplasia score were calculated, and the pulmonary vascular lesions were analyzed using elastic fiber staining. Results RVHI, ACE2 enzyme activity and WT in the group A were significantly different from those of the groups C, D and E (P<0.05). Those of the group D and E were significantly different (P<0.05). The five groups showed significant differences in the overall analysis of each index (P<0.05). Conclusions Diminazene can increase the ACE2 enzyme activity, and decrease the mPAP, RVHI and WT, while reducing the pulmonary arterial medial hypertrophy, and inhibit intimal hyperplasia of pulmonary arterioles. The results of this study provide an experimental basis for the use of diminazene in the treatment of human pulmonary hypertension.

Diminazene; Monocrotaline; Pulmonary hypertension; Rat

周康(1969-)，男，副主任医师、副教授，从事心血管内科方面的研究。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0034-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.006

2016-11-14