超声法提取杏鲍菇菌糠总黄酮工艺

楚禄建　刘阳　朱单洁　李佩佩　李热　贺晓龙　王延峰

摘 要：对杏鲍菇菌糠中总黄酮含量进行提取，以获取最佳提取工艺。采用超声辅助提取法，以总黄酮得率为指标，利用单因素考察了乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率对杏鲍菇菌糠中总黄酮提取率的影响；在单因素基础上利用正交试验设计对超声辅助提取工艺进行优化。结果表明，杏鲍菇菌糠中总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度70%，料液比1∶30 （g·mL-1），超声时间25 min，超声功率350 W，该提取条件下，总黄酮的提取率为1.995%±0.019%。在该条件下总黄酮得率较高且比较稳定，具有一定现实意义。

关键词：杏鲍菇菌糠；总黄酮；超声波辅助法；提取率

中图分类号：S646.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.011

Abstract： In order to obtain the best extraction process， the content of total flavonoids in P.eryngii was extracted from this experiment. Ultrasound assisted extraction was used， took the yield of total flavonoids as the index， the effect of ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power on total flavonoids extracted from eryngiibacterial chaff was reviewed. The results showed that the optimum extraction process of total flavonoids from eryngiibacterial chaff were ethanol concentration 70%， material liquid ratio 1∶30 （g·mL-1）， ultrasonic time 25 min， ultrasonic power 350 W， under this extraction condition， the extraction rate of total flavonoids was 1.995%±0.019%. And under this condition， the yield of total flavonoids was high and relatively stable.

Key words： P.eryngii funigus chaff； total flavonoids； ultrasonic method； extraction rate

杏鲍菇菌糠，又名菌渣、菌糠、杏鲍菇菌渣等，是指已经出菇之后，营养成分被完全利用或未被完全利用的菌包。工厂为了追求最大的经济利益，杏鲍菇在实际生产过程中，通常只出一潮菇，这使得菌包中的营养成分不能被完全利用，便随意堆积或者随处丢弃，在造成严重资源浪费的同时，也给生态环境带来了严重的污染[1]。本研究欲从杏鲍菇菌糠中提取黄酮类化合物，旨在为了减少菌糠不能完全利用带来的资源浪费以及随意丢弃造成的环境污染。

黄酮类化合物是自然界广泛存在的一种天然化合物，有多种药用价值，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老等作用，已成为国内外研究的热点[2]。目前，有关黄酮类化合物提取的方法有很多种，如水提法、醇提法、微波辅助法、超声波辅助法、酶解法、高压脉冲电场辅助提取法等。其中超声波辅助提取法是利用超声波产生的机械振动作用和空化作用，破坏植物细胞结构，加速胞内有效成分的释放与溶出的一种新方法。超声提取技术与传统的浸泡法相比，加快了活性物质的浸提速度，缩短了时间，提高了活性成分的提取率[3]。因此，本研究选用超声波辅助提取法来研究此法对杏鲍菇菌糠总黄酮提取含量的影响。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂及仪器

杏鲍菇菌糠，由延安大学生命科學学院提供，烘干，粉碎，过筛（备用）；芦丁标准品，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、强氧化钠等，均为国产分析纯。

FW100型高速万能粉碎机；101-3BS型电热鼓风干燥箱；SCIENZ-ⅡD超声波细胞粉碎机；DK-98-1型电热恒温水浴锅；SHZ-D（HD）循环水式真空泵；RE-52型旋转蒸发仪；UV-2600紫外可见分光光度计等实验室常用仪器和设备。

1.2 试验方法

1.2.1 杏鲍菇菌糠总黄酮的提取工艺 新鲜菌糠→干燥至恒质量→粉碎→过孔径0.25 mm的筛→石油醚脱脂→回收石油醚→超声提取→过滤→定溶→测定[4-6]。

1.2.2 标准曲线的测定 取一定量芦丁为标品，在110 ℃烘干至恒质量，精确秤取10 mg芦丁标准品，用70%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，使其浓度为100 μg·mL-1。再将此溶液用70%乙醇溶液分别稀释至0，20，40，60，80，100 μg·mL-1。然后各取1 mL于10 mL具塞比色管中，各加70%乙醇溶液1 mL，5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；再加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再加入4%NaOH溶液2 mL。最后用蒸馏水定容至5 mL，摇匀，静置15 min。以加入0 mL芦丁标准品溶液的比色管作为参照，在510 nm处测其吸光度A，以芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 杏鲍菇菌糠总黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系络合化学吸光法于510 nm处测定提取液中的吸光度，从而确定总黄酮含量。计算公式如下：

黄酮含量=（C×V1×N）/（W×V2×1 000） ×100%

式中：C为提取液中黄酮含量（mg）；V1为总样品体积（mL）；N为稀释倍数；W为样品质量（g）；V2为测定样品体积。

1.2.4 乙醇浓度对总黄酮含量的影响 准确称量杏鲍菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入不同浓度乙醇水溶液30 mL，设定超声时间15 min，超声功率250 W，乙醇浓度分别为50%，60%，70%，80%，90%。冷冻离心后取上清液测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。

1.2.5 料液比对总黄酮含量的影响 准确称量杏鲍菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入不同倍数的70%乙醇水溶液，设定超声时间15 min，超声功率250 W，乙醇用量分别为20，25，30，35，40 mL。冷冻离心后取上清液测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。

1.2.6 超声提取时间对总黄酮含量的影响 准确称量杏鲍菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入70%乙醇水溶液30 mL，设定超声功率250 W，超声提取时间分别为5，10，15，20，25 min。冷冻离心后取上清液测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。

1.2.7 超声功率对总黄酮含量的影响 准确称量杏鲍菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入70%乙醇水溶液30 mL，设定超声时间15 min，超声功率分别为50，100，150，200，250 W。冷冻离心后取上清液测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。

1.2.8 正交试验设计 以总黄酮的得率为指标，在单因素基础上，选取每个因素提取率最佳的3个水平，设计L9（34）表进行正交试验，优化杏鲍菇菌糠中总黄酮提取工艺条件，如表1所示。

2 结果与分析

2.1 黄酮标准曲线

以芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。

2.2 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

由图2可知，在乙醇浓度小于70%时， 总黄酮的提取率随溶剂浓度增大而增大，当乙醇浓度超过70%以后呈下降趋势，说明乙醇浓度过高或过低对提取率都有影响。这可能是由于不同浓度的乙醇溶液极性不同，而黄酮类化合物具有较高的极性[7]。根据相似相溶原理，本研究选择乙醇浓度为70%。

2.3 料液比对总黄酮提取率的影响

由图3可以看出，随着料液比的增大，提取率相应增高，这主要是因为液料比越大，黄酮类化合物就越容易渗透出来；但是由于黄酮含量有限，料液比达到1∶30（g·mL-1）以后，提取率的增加就趋于平缓。考虑节约乙醇，故选择适宜的料液比为1∶30（g·mL-1）。

2.4 超声提取时间对总黄酮提取率的影响

由图4可以看出，在超声波功率等其它因素固定的条件下，超声处理时间越长，超声波对物料的作用越充分，黄酮浸出越多，提取率越高。但20 min以后，提取率增高趋于缓慢，可见超声波能在较短时间内对物料进行充分提取，从而验证了超声波提取具有省时的优点。考虑到能源消耗等各方面因素，确定20 min为较适宜的超声处理时间。

2.5 超声功率对总黄酮提取率的影响

由图5可知，超声波的功率越高越容易获得较大的声强，超声功率从100 W到500 W时，随着功率的提高提取率也上升，这可能是因为超声强度越大越容易使细胞内容物溢出，越有利于提高提取效率[8-10]。但在功率为400 W时，提取率仅比500 W时的提取率少0.04个百分点。因此，确定400 W为适宜的提取功率。

2.6 正交试验结果及分析

由表2可知，在试验选定的4个因素中，对杏鲍菇菌糠总黄酮提取率的影响程度大小依次是B>C>A>D，即料液比>超声时间>乙醇浓度>超声功率。由于A因素，k3>k2>k1；B因素，k2>k3>k1；C因素，k3>k2>k1；D因素，k1>k3>k2；所以得出杏鲍菇菌糠总黄酮的最佳提取工艺为A3B2C3D1，即乙醇浓度70%，料液比1∶30（g·mL-1），超声时间25 min，超声功率350 W。

2.7 最佳工艺验证试验

在正交试验所得出的最佳工艺条件A3B2C3D1下，重复3次试验，计算该条件下提取率为1.995%±0.019%，RSD为0.981%，表明该结果稳定可靠。

3 结论与讨论

本研究利用超声辅助法提取杏鲍菇菌糠中黄酮类化合物，既缩短了提取时间，又达到较高的提取效率，与传统水提法、醇提法相比具有省时、高效、节能的优点。研究表明，在乙醇浓度70%，料液比1∶30（g·mL-1），超声时间25 min，超声功率350 W的条件下，杏鲍菇菌糠的提取率达到最大值1.995%±0.019%，且重复性高，相对稳定。

为了更加合理地开发利用菌糠资源，本研究采用了超声辅助提取法研究杏鲍菇菌糠中总黄酮的含量，旨在获取最佳提取工艺，为菌糠资源的开发利用提供技术参考。另外，由于本研究仅考虑了醇浓度、料液比、超声时间、超声功率4个因素，没有涉及到提取中所面临的全部因素，因此在实际生产过程中还需综合考虑各种外界因素，比如提取温度、料液pH值等，还需要在本研究的基础上做进一步研究。

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