抗菌肽的国内外研究进展

燕晓翠　杨春蕾　姚大为　马毅　胡香玉　白忠良　郑成江　范寰

摘 要：抗菌肽为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要组成部分，因其抗菌作用机制特异，能够迅速杀菌且不易导致耐药性，可单独使用或与抗生素联合作用，成为一类具有极大发展潜力的天然药物。综述了抗菌肽的来源和生物学活性，重点阐述了近年来抗菌肽研发与应用的国内外进展及其发展前景。

关键词：抗菌肽；来源；生物学活性；研发；应用

中图分类号：S853.7 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.008

Abstract： Antimicrobial peptides are important components of the natural defenses of most living organisms against invading pathogens. The unique antibacterial mechanism， direct bactericidal effect， relatively slow of resistance acquirement， and can use alone or combine with antibiotics， make antimicrobial peptides be attractive potential antibacterial drugs. This paper reviewed the source of antibacterial peptides and biological activity， and emphatically introduced domestic and abroad research progresses and prospects of antimicrobial peptides.

Key words：antibacterial peptides； source； biological activity； research and development；application

自青霉素發现以来，抗生素开始在全球广泛应用，人类逐渐进入控制和治疗微生物感染性疾病的时代，抗生素在人类疾病的预防与治疗、养殖业的产品数量与质量提高方面发挥了重要的作用。然而，各类抗生素的滥用却导致了致病菌的进化加速，造成耐药菌及多重耐药菌大量出现的现状。但是抗生素的研发并没有跟上抗药性细菌进化的速度，而且西方很多抗生素生产公司由于产品经济效益不大，且报批困难等原因，陆续退出了抗生素药物的研发，从而导致近年来新批准的抗生素类药物在不断地减少，甚至出现新抗生素的研发空白。耐药细菌及多重耐药细菌的不断出现及进化与抗生素的研发空白，使得新型抗菌药物的开发迫在眉睫[1]。近些年，研究工作者对寡聚糖、益生菌、植物提取物、抗菌肽等添加剂进行了大量的研究，力图寻找其替代抗生素的可行性，尤其是普遍存在于生物体内、具有多种生物学功能的抗菌肽[2]，被发现具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特[3]，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，在蛋白质分子四级结构和物理化学性质方面显示出的多样性等多重优势。因此，抗菌肽成为国内外动物和人类医学、营养学、饲料（食品）学和免疫学等领域研究和开发的热点，生物抗菌肽的开发利用有望成为解决耐药菌问题的理想途径，有着广阔的开发应用前景[4]。

1 抗菌肽的来源

到目前为止，已发现了2 600多种抗菌肽[5]，它们分布广泛，病毒、细菌、真菌、鱼类、鸟类、昆虫、两栖动物、软体动物和哺乳动物等生物中均有分布。

1.1 微生物抗菌肽

微生物抗菌肽有细菌抗菌肽和病毒抗菌肽2类。其中，来自细菌的抗菌肽也被称为细菌素，细菌素是在代谢过程中某些细菌通过蛋白分子产生途径生成的一类带有杀菌生物活性的多肽分子或前体多肽分子，通常这些多肽分子都是一些阳离子氨基酸链，具有疏水性或两亲性。根据生物化学性质，细菌素可分为3 类：Ⅰ类细菌素、Ⅱ类细菌素和Ⅲ类细菌素。其中，Ⅰ类细菌素又被称为硫醚抗生素，分子质量小于5 ku，氨基酸数量大概在19～38个，具有黏膜活性，耐热性也较好，其结构中含有少见的硫醚氨基酸，如羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨（β-methyllanthione），分为A型lantibiotics 和B型lantibiotics共2类。Ⅱ类细菌素是近年来发现的一类被称为乳酸细菌素的细菌抗菌肽，基于它们的生物学性质和理化特性，可作为食品保藏剂。与Ⅰ类细菌素相比，Ⅱ类细菌素的分子质量稍小（4～6 ku），具有热稳定性，又可以分为4 小类。Ⅲ类细菌素是由细菌的前蛋白转位酶分泌的，分子质量大于30 ku，耐热性好[6]。另一类是病毒抗菌肽，这一类抗菌肽目前发现种类比较少。其中，LLPs是由人类缺陷病毒1型（HIV-1）跨膜蛋白的C 末端序列编码的慢病毒细胞溶解肽，对微生物和细胞毒性作用很强；LLPs 精氨酸含量高且不含赖氨酸[7]。大多数情况下，微生物抗菌肽是以环状结构存在的。

1.2 植物抗菌肽

植物抗菌肽对植物病原体以及感染人的细菌病原体都有活性作用，是植物防御系统的屏障，被认为是具有重要应用前景的抗生素类多肽。常见的植物抗菌肽有硫素、防御素、环肽类蛋白、脂质转移蛋白、细胞穿透肽、蜕皮素等，它们具有相似的特征，如带有正电荷、具有二硫键（稳定蛋白结构）作用的靶位点都位于细胞外膜等[8]。

1.3 昆虫抗菌肽

昆虫是生物界中种类最丰富的生物，大约有100多万种，同时具有很强的适应能力和发达的防御机制。抗菌肽是昆虫在受到外界环境刺激时，由血淋巴或机体相关部位产生的一类多肽，其是昆虫体液免疫系统的有机组成部分，在整个免疫系统中发挥着重要作用，其脂肪体（功能类似于哺乳动物的肝脏）分泌的抗菌肽对各系统的病原体起抑制作用。迄今为止，在昆虫体内分离到的抗菌肽大约有200多种，这些多肽根据其抗菌机制及氨基酸的序列组成被分为5 种：cecropins、溶菌酶、防御素、富含甘氨酸的多肽及富含脯氨酸的多肽[9]。

1.4 两栖动物抗菌肽

两栖类动物的皮肤外露、湿度较高，并具有一定的呼吸功能，这种形态及生理的特异性要求其仅能在潮湿的环境中生存，这同是一些病原微生物生存的极佳环境。为了开拓和适应广阔的栖息地及多样的生态环境，通过不断地选择进化，两栖类动物最终形成了可抵御病原微生物的防御系统。皮肤腺体释放的先天性免疫的重要效应分子——抗菌肽，在两栖类动物受到肾上腺素、应激、外伤等因素刺激时，在两栖类动物的免疫防御机制中有重要效应。经过长期进化，抗菌肽基因出现了多重复制和突变，产生出大量结构和种类繁多的抗菌肽。目前，已有1 400种抗菌肽从两栖类动物皮肤分泌物中分离出来，不同来源的分泌物中含有不同的抗菌生物活性分子。两栖动物抗菌肽根据其结构特点可分为2类：含有分子内二硫键的环状抗菌肽和具有α-螺旋结构的线性抗菌肽[10]。

1.5 哺乳动物抗菌肽

哺乳动物体内抗菌肽只对外源性病原菌具有杀伤作用，而对动物体自身正常细胞无害。哺乳动物抗菌肽主要存在于黏膜的上皮細胞和中性粒细胞及皮肤，如呼吸道中的表面活性物质阴离子抗菌肽，上皮组织中的防御素，这些抗菌肽与吞噬细胞共同建立了机体的第一道防线[11]。哺乳动物抗菌肽主要分为2类，即防御素（defensins）和cathelicidins。研究最多的防御素类抗菌肽，是抗菌肽家族最大的一类。哺乳动物防御素分为α-defensins和β- defensins两大类[12]。

1.6 海洋生物抗菌肽

海洋是生命的起源地，也是生物的巨大生存地，推算得知，全球约1/2的生物生活在海洋中。这一巨大生物库中蕴藏着丰富的抗菌活性物质，此前已证明，种类繁多的海洋生物能产生多种多样的抗菌肽，其中关于海洋动物抗菌肽的研究占大多数。海洋脊椎动物中以鱼类分泌抗菌肽报道最多，因其身体结构的特异性，抗菌肽主要分泌到海洋鱼类的黏液层，其作为非特异性免疫系统的第一道屏障，将致病细菌在进入生物机体前杀灭。海洋生物抗菌肽具有合成分泌迅速，扩散速度快和灵活等特点，是其他免疫系统成分作用功能所不及的。海洋无脊椎动物如软体动物、被囊动物、甲壳动物等主要依靠体液免疫和细胞反应的先天免疫机制作为防御系统。而其中抗菌肽作为先天免疫防御系统的一个重要组成成分，能快速和即时地对入侵的病原微生物做出反应[13]。

2 抗菌肽的生物活性

2.1 广谱抗细菌活性

经试验证明，抗菌肽具有广谱抗细菌活性。乳酸链球菌素和天蚕素有抗铜绿假单胞菌的活性，而且与Ranalexin和BuforinⅠ联合应用对氨苄西林抗性的表皮葡萄球菌有明显的灭菌效果。抗菌肽对囊括了革兰氏阳性、革兰氏阴性以及革兰氏兼性的细菌都具有杀伤作用。绝大多数抗菌肽能够抵抗革兰氏阳性细菌，但在抗菌活性方面不同种抗菌肽间存在较大差异，且抗菌谱也有差异[4]。研究显示，2种或多种抗菌肽间甚至抗菌肽与传统的抗生素之间在作用于同一细菌时有辅助和协同作用，将抗菌肽和抗生素同时使用能够增强治疗效果，或者拓宽二者的抗菌谱[9]。

2.2 抗真菌活性

抗菌肽具有抗真菌作用，目前，已经发现的抗真菌肽有果蝇抗菌肽、贻贝素、线肽素、蝎血素、cecropins以及通过人工改造形成的抗菌肽等[14]。研究表明，抗菌肽抗真菌活性的强弱与真菌的属、种和孢子的状态有关[15]。例如，天蚕素对镰刀菌属的病原菌和曲霉菌属有抑菌作用。来自人和灵长类动物分泌的唾液组蛋白也有抗真菌的活性，它是通过与真菌细胞的胞膜受体结合，然后进入细胞并定位于线粒体，灭菌机制可能是通过诱导胞体三磷酸腺苷丢失引起细胞凋亡[2]。

2.3 抗病毒活性

研究表明，多种抗菌肽如人鲎源抗菌肽美洲鲎素（polyphemusin）、牛中性粒细胞indolicidin、α-防御素（humanα-defensin，HNP）等都具有抗病毒活性。抗菌肽可能利用多种抗病毒机制发挥活性，被作用的病毒具有相似的结构特征：具有膜结构，如疱疹病毒型口炎病毒、疱疹病毒和艾滋病病毒[16]。部分抗菌肽通过与病毒膜结构的直接结合发挥抗病毒活性，如美洲鲎素对HIV病毒的作用和α-防御素对疱疹病毒的作用等。部分抗菌肽可以阻止病毒的繁殖，如蜂毒素（melittin）、天蚕素A（cecropinA）在亚毒性浓度下通过抑制基因表达来阻止HIV-1 病毒的增殖[9]；还有部分抗菌肽，如蜂毒素是通过扰乱病毒的组装程序而对病毒产生抑制效应[4]。

2.4 抗寄生虫活性

抗菌肽还可用于治疗宿主感染、控制传染疾病传播，或预防和阻止携带寄生虫的昆虫宿主造成的疾病传播。某些抗菌肽能够高效地将寄生于动物或人类体内的寄生虫杀死[9]。抗菌肽作用于原虫的胞膜，能够间接引起细胞的细胞器和内部结构的改变，扰乱细胞的正常代谢，从而杀灭寄生虫[17]。

2.5 抗癌细胞活性

抗菌肽能对某些肿瘤细胞有特异性的抑制作用，而对机体正常体细胞没有负面影响。已有文献报道，抗菌肽对肝癌细胞[18]、膀胱癌细胞[19]和宫颈癌细胞[20]的杀伤作用以及剂量的相关研究，如SUTTMANN等[19]通过试验证明，一定剂量的天蚕素A和天蚕素B可以有效抑制膀胱癌细胞的生存和繁殖（天蚕素A和天蚕素B针对所有膀胱癌细胞的MIC50为73.29～220.05 g·mL-1），相比之下对正常成纤维细胞几乎没有影响。

3 抗菌肽开发应用

3.1 抗菌肽研发

抗菌肽因其独有的广谱抗菌、调节先天免疫和不易产生耐药性等诸多特性而备受关注。目前，已有抗菌肽产品得到开发应用，并且反应效果良好。但是纯天然的抗菌肽大量开发应用依然不足，如天然产量少、毒副作用大、生产成本高和生产条件复杂等。因此，基于其物理性质和化学性质对抗菌肽进行分子设计、优化表达系统、结构改造和修饰是研发阶段的首要问题，也是控制整体大规模生产的主要因素[21]。

3.1.1 抗菌肽分子改造 现阶段，抗菌肽改造主要追求实现降低毒性和提高其抗菌活性两大目标。改造手段主要包括残基取代和截断、构建杂合肽等。许多人工改造分子设计都是针对其各种氨基酸组成比例与序列进行改编。这类改造方法分2种，一是只改变氨基酸的顺序而不改变其种类；二是通过氨基酸的种类增减，从而使其因结构的变化而产生新性能。突变可引起氨基酸残基的替换、插入、移码或者删减等，是研究抗菌肽结构功能时的常用方法。通过对抗菌肽分子改造修饰，能使其功能产生显著优势变化，如抗菌活性提升、抗癌能力加强、高表达量和溶血性减弱等。明飞平等[22]通过PCR 敲除抗菌肽PR39 的5' 24个核苷酸，再人工构建已删除8个核苷酸的新型表达载体pPIC9K-PR39-D-E，改造后的抗菌肽对E. coli DH5α有明显的抑菌活性。天然抗菌肽中部分结构对其活性没有影响，甚至较大的肽链会对抗菌肽的稳定性、免疫原性等产生影响。研究证明[23]，仅含有8个氨基酸的Temporin-SHf抗菌肽具有抗菌谱较广的特性。因此，截断去除其多余结构、保持活性部分是重要改良措施之一。如对含有半胱氨酸残基的植物AMPs 的thionin 通过多点截断后得到一条与亲本AMPs 活性相同的小分子AMPs，其同亲本一样对多种病原菌均表现出明显的抗性[24]。目前，杂合肽是抗菌肽分子改造中应用最广泛的方法之一，研究者们借鉴蛋白质工程和酶工程生产杂合蛋白和杂合酶，通过分析不同抗菌肽的理化性质和活性，通过重组的方法将2 种不同抗菌肽的选定部分重新组合，形成一个新的杂合抗菌肽，从而获得毒副作用更小和活性更高的杂合肽。XU等[25]通过选择Cecropin A 中的1～8个氨基酸序列与Magainin 2序列中1～12个氨基酸序列进行拼接，构建杂合肽，并在大肠杆菌中实现了异源高效表达且稳定性有所增加。在对于低毒性抗菌肽序列设计和构效关系研究中，TIAN 等[26]依据天蚕素Cecropin A，幽门螺杆菌肽HP（2～20）和乳铁蛋白肽Lfcin （W4，10）等亲本肽特性，设计组建新杂合抗菌肽LH28，对G+菌如枯草芽孢杆菌、G-菌如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有广谱抗菌特性（MIC50：1.56～3.13 mol·L-1）。XI等[27]后来又尝试引入柔性接头（GGGGS）3 和高抗G+菌的抗菌肽Plectasin部分序列，设计构建新杂合肽LHP7，结果发现，其对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为0.091 μmol·L-1，而杂合母体肽LH28浓度要求为 LHP7 的35.39倍，且该新杂合肽溶血特性极差，即使在1 000 mg·L-1高浓度条件下溶血率也低于5%，而相同浓度杂合母体肽LH28的溶血率是LHP7 的7倍（35%）。

3.1.2 选择和优化表达系统 抗菌肽的表达系统分为3类：杆状病毒表达系统、真核表达系统和原核表达系统。这3 种表达系统各有突出特点，因此不同抗菌肽在表达时可根据其自身性质与特点选择对应表达系统，并通过对其改造修饰进行系统优化。原核表达系统一般是大肠杆菌表达系统，其具有培养条件简单、繁殖速度快等特点，易进行大规模生产。但因其是原核生物，不具备真核生物精确的蛋白加工系统，且表达量很少。酵母菌表达宿主是一种最常用的可以表达并精确修饰蛋白的真核表达系统，酵母表达系统与原核表达系统相比，特点主要体现在表达后对蛋白的修饰加工作用，比如糖基化的修饰[28]。杆状病毒表达系统适用范围广且表达效率高，与前面2个表达系统相比，杆状病毒表达系统操作相对简便，昆虫细胞培养简捷，且经济成本低，外源基因表达量高和具有翻译后蛋白修饰加工功能[21]。

有时人们使用的载体不一定完全适合表达系统，因此，不少研究是针对表达系统的不断优化。将抗菌肽（已改）与表达系统功能蛋白氨基酸杂交是一种很好优化表达系统的方法，LI等[29]将人类β-防御素分别与溶菌酶、凝集素和甘露糖进行杂合；体外抑菌试验结果证明，杂合肽对抗青霉素的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 表现出的抑菌效果较明显，且杂合肽的抗菌活性比其亲本更强。在提高抗菌肽表达产量及稳定性方面，密码子优化是最为有效的方法。构建抗菌肽表达载体时加入宿主系统菌偏好型密码子，便可使载体高效表达出抗菌肽。这类抗菌肽密码子不但能够有效地表达抗菌肽，而且还减少了抗菌肽对宿主细胞的毒副作用[30-31]。REN等[32]根据抗菌肽基因SMAP-29的氨基酸序列及其表达系统毕赤酵母偏好性密码子，设计并合成SMAP-29的成熟基因片段的表达载体，且在诱导表达的第2天检测到了预期抗菌肽，并通过试验证明，其对白色念球菌和金黄色葡萄球菌都有显著的抑菌作用。此外，组建不需要酶切的表达载体和5' 非翻译区序列改建等也是常用的优化表达载体的方法。

3.2 抗菌肽的应用

3.2.1 抗菌肽在医学上的应用 抗菌肽因具有显著、广谱抗菌、抗肿瘤活性，以及能够加快伤口愈合和增强机体免疫等特性，使其作为天然药物最终能够完全代替传统抗生素和抗肿瘤药物成为可能。研究表明，抗菌肽能特异地抑制某些目的肿瘤细胞的生长，同时对人体正常细胞无害，这给其替代传统抗癌药物的开发带来更大希望。KIM等根据已知序列的天然AMP氨基酸，通过增减或替换的方法构建出抗菌肽GGN6，其可以诱导癌细胞凋亡，并对具有耐药性的乳腺癌细胞系有明显的杀伤作用。由于抗生素的不科学使用，使“超級细菌”不断增多，抗菌肽的出现能有效地解决细菌耐药性的问题，抗菌肽的杀菌作用机制与传统抗生素不同，突出的特性使其代替传统抗生素成为趋势[33]。抗菌肽可在不影响人体健康细胞活性的前提下对人直肠癌HR 8340、艾氏腹水瘤EAC、髓样白血病细胞k552 株、人宫颈癌细胞及肝癌细胞BEL27402 等起到抑制作用[34]。抗菌肽对HIV、疱疹病毒等一系列具有膜结构病毒都有一定的杀伤作用：cecropins 和meliiins在亚毒性浓度下可以通过影响其基因表达的作用机理来抑制艾滋病病毒的增殖[35]。除此之外，抗菌肽还能加速伤口处细胞的分裂增殖，如LL-37通过加速呼吸道上皮细胞增殖与移动，加速伤口的愈合[36]。目前，已经有许多抗菌肽药物逐步迈入医药领域。例如，应用两栖类抗菌肽magainin 开发的抗菌肽药品MAI278已经快要完成Ⅲ期临床试验，对肿瘤细胞和病毒都显示具有明显的杀伤作用。中国科学院昆明动物研究所鉴定了超过500种的抗菌肽分子，占全部已知抗菌肽的30%，建立了中国抗菌肽数据库。通过筛选得到了10个以上的具有抗感染药物开发潜力的抗菌肽候选药物，并已经完成除安全评价以外的大部分临床前研究数据[37]。

3.2.2 抗菌肽在农牧业上的应用 由食品和饲料安全问题而展开的饲料用抗生素替代品的研究是畜牧业研究与生产的热点问题，抗菌肽由于自身的天然特性显示了其在农牧业上广泛的应用前景。抗生素容易导致动物胃肠道中菌群平衡遭到破坏，很多还会长期残留在动物体内，严重降低农副产品质量和影响人类饮食健康。此外，抗生素的长期滥用会导致耐药性菌株产生，从而引起大面积的动物疫情[38]。而有研究表明，添加有抗菌肽的反刍动物饲料，可以有效提高瘤胃pH值，进而增加动物食欲和动物体重。另一方面，动物机体自身产生的抗菌肽，在预防或治疗反刍动物疾病方面有较好的应用前景。抗菌肽在治疗子宫内膜炎、奶牛乳房炎、犊牛细菌性腹泻等病症方面有较明显的效果，并且没有在血液和牛奶中检测到残留。基于这些研究结果，为抗菌肽作为添加剂在反刍动物饲料中的应用增添了更多的说服力[39]。仔猪在断奶期间，容易引起身体应激，导致仔猪腹泻。有研究表明[40]，抗菌肽的杀菌作用能够防止仔猪细菌性腹泻，改善断奶仔猪应急综合征，加速仔猪适应能力。复合抗菌肽能够有效提高断奶仔猪血清抗氧化功能，增强仔猪抗断奶应激能力[41]。有研究表明，在仔猪日粮中添加300 mg·kg-1的抗菌肽，可以提高仔猪的抗氧化和免疫功能及减少仔猪盲肠中大肠杆菌的数量，对于盲肠的有益菌群没有不良影响，同时不影响垫料蛋白酶、脲酶活性和垫料铵态氮含量。彭翔等[42]研究发现，抗菌肽对肉仔鸡有促进生长和提高免疫力作用，联合姜黄素使用效果更佳。

3.2.3 抗菌肽在水产养殖上的应用 水产养殖一直受细菌病的困扰，抗生素又会在水产动物体内长期残留，破坏肠道正常的菌群平衡，也会影响生态平衡。而研究表明，在水产动物养殖饲料添加抗菌肽，能够直接调节水产动物的生理功能，显著提高水产动物的成活率和消化率，有效提高机体抗氧化能力和免疫力。宋理平等[43]研究发现，抗菌肽对凡纳滨对虾体质量增加具有促进作用。姜珊等[44]研究发现，在罗非鱼饲料中添加抗菌肽，可以显著加速罗非鱼的质量增加。柴仙琦等[45]研究发现，在凡纳滨对虾饲料中分别添加300，400 mg·kg-1抗菌肽，可显著提高血清碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶及溶菌酶活性。

4 展 望

随着对抗菌肽结构、表达调控和作用机制研究的不断深入，有目的地对抗菌肽进行人工设计和改造，甚至于人工合成抗菌肽，更好地解决抗菌肽的抗菌活性、溶血活性和表达量等问题，为研究优化新的表达系统和发酵工艺提供理论依据，为探究大规模表达抗菌肽的途径提供思路。抗菌肽的种类繁多，不同的抗菌肽在大规模生产技术上依然存在种种问题，随着基因工程技术的不断进步和改良，这些困难有望逐一得到解决。希望通过利用异源表达系统，生产出用途更廣、种类更多和效果显著的抗菌肽产品，使抗菌肽更好地服务于人类生活。

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