糖肾方不同提取工艺治疗糖尿病肾病的药效学比较研究

张浩军，赵婷婷，刘 鹏，严美花，赵海玲，孔 勤，张并璇，李 平

（中日友好医院 临床医学研究所；北京市免疫炎性疾病重点实验室，北京 100029）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为糖尿病严重的微血管并发症，已成为我国慢性肾脏病的首位病因[1]。中医药治疗DN特色与优势明显，本课题组在继承名老中医经验基础上研制了糖肾方，由黄芪、生地等7味中药组成，具有益气养阴，活血化瘀之功效，前期RCT临床试验和体内动物实验均显示其疗效确切[2，3]。为了将其开发为安全有效、服用方便的中药新药，根据方中药味成分理化性质及药理活性，分别设计了3种提取工艺，利用单侧肾切除合并STZ诱导的DN大鼠模型进行药效学评价，以确定最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠 220只，雄性，体重为 180～220g，购自中国军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK-（军）2012-0004。

1.2 糖肾方提取供试样品的制备

本方由黄芪、生地、大黄、三七、酒萸肉、鬼箭羽及枳壳7味药组成，根据药味所含成分理化性质、成分活性文献报道及前期研究基础，共设计以下三个提取工艺：

工艺1（传统水提）：称取处方量药材，除三七粉碎成细粉外，其余六味药加水提取2次，浓缩干燥，与三七粉混合过筛。

工艺2（醇提加水提）：称取处方量药材，酒萸肉、三七用60%乙醇提取2次，减压浓缩；其余5味药加水提取2次，浓缩，醇沉过滤，减压浓缩，干燥后混合粉碎过筛。

工艺3（醇提加水提）：称取处方量药材，酒萸肉、三七、熟大黄用60%乙醇提取2次，减压浓缩；其余4味药加水提取2次，浓缩，醇沉过滤，减压浓缩，干燥后混合粉碎过筛。

1.3 试剂与药品

福辛普利钠片（中美合资上海施贵宝制药有限公司，10mg/片），链脲佐菌素（美国 Sigma-Aldrich公司），大鼠白蛋白测定试剂盒（美国Bethyl公司）。

1.4 实验仪器

代谢笼（苏州冯氏实验动物设备有限公司）；倍易血糖仪（美国强生公司），CD-1600全自动生化分析仪（美国雅培公司），Model 680酶标仪（美国伯乐公司），BX-51光学显微镜及DP-70图像采集系统（奥林巴斯公司）

1.5 动物造模

雄性Wistar大鼠，适应性喂养1周，进行基础状态测定，剔除血糖与尿蛋白异常的动物3只。其余大鼠以3ml/kg腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，常规消毒，背部切口1～1.5cm，暴露右肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎右肾门血管，切除右肾，缝合切口。术后动物恢复1周后，按40mg/kg腹腔注射1%的链脲佐菌素（用0.1mol/L的pH4.5的柠檬酸缓冲液配制），72h后尾尖采血测血糖，以高于16.7mmol/L为造模成功。

1.6 分组与给药

造模成功大鼠165只，按血糖水平随机分为11组，模型组，工艺1低、中、高剂量组（TSF1-L，TSF1-M，TSF1-H）、工艺2低、中、高剂量组（TSF2-L，TSF2-M，TSF2-H）、工艺 3 低、中、高剂量组（TSF3-L，TSF3-M，TSF3-H）（各工艺低、中、高剂量分别相当于糖肾方 2.5，5，10g 生药/kg·d）和阳性药对照组（2.0mg/kg·d福辛普利钠），每组15只。另取15只未造模动物进行假手术，仅暴露右肾不做其它处理，1周后腹腔注射柠檬酸缓冲液，作为正常对照组。正常对照组和模型组动物给予同容积蒸馏水，连续给药12周。

1.7 标本采集

造模后第0、4、8、12周，大鼠尾尖采血测血糖，同时将大鼠转入代谢笼内，禁食给水，收集8h尿液。实验结束时水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清，并摘取左肾，横切后取中间部分固定于10%中性甲醛溶液进行组织病理学检查。

1.8 指标检测

一般状态：动物每周称体重，密切观察动物精神状态，反应性，毛发色泽，饮食及排泄状况。

尿白蛋白：将各时间点收集的尿液以8000转/分离心10min，吸取上清，按试剂盒说明书用ELISA法检测尿白蛋白，用自动血生化分析仪测定尿肌酐；计算尿白蛋白/肌酐比值。

血生化指标：用强生OneTouch Ultra II稳豪血糖仪测定各时间点血糖值，血清样本用全自动血生化分析仪测定血清总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、 肌酐（creatinine，Cre）、 谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、 谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

组织病理学指标：肾组织用10%中性甲醛溶液固定24h后，乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚度3μm，进行PAS染色，光镜下观察肾组织病理学变化。

1.9 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计学分析，单变量方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 实验组大鼠一般状态及体重变化

从实验开始，模型大鼠出现饮食饮水量增加，排尿增多，动物消瘦，毛色发黄，精神状态变差，实验期间动物死亡9只，其中TSF1-L死亡2只，TSF1-H死亡1只，TSF2-M死亡1只，TSF2-H死亡2只，TSF3-L死亡1只，TSF3-H死亡2只。与正常对照组比，模型组大鼠体重显著降低，糖肾方3个工艺3个剂量均对模型大鼠体重无明显影响（图 1）。

2.2 实验组大鼠血糖变化

造模后，模型组大鼠各个时间点血糖水平显著高于正常对照组，糖肾方3个工艺各剂量组血糖水平与模型组大鼠相比无显著性差异，表明糖肾方无明显的降血糖作用（图2）。

2.3 实验组大鼠尿蛋白肌酐比值变化

与正常对照组比，模型组尿白蛋白肌酐比值显著升高，TSF1-M和阳性对照药显著降低模型大鼠尿白蛋白肌酐比值，其余各给药组与模型组比，尿白蛋白肌酐比值无统计学差异（图3）。

2.4 实验组大鼠肾功、TP及ALB变化

与正常对照组比，模型组大鼠血清BUN和Cre水平显著升高，TP与ALB水平显著降低。糖肾方3个工艺各剂量与阳性药蒙诺对模型大鼠血清BUN水平无明显影响，但显著降低模型大鼠Cre水平。与模型组比，TSF1-M组血清ALB水平明显升高，TSF2-M组TP水平显著升高，其余各给药组血清TP与ALB水平与模型组无显著性差异（表 1）。

2.5 实验组大鼠血脂及肝功变化

正常对照组与模型组血清T-CHO、LDL-C和AST水平无统计学差异，TG水平和HDL-C显著降低，ALT水平显著升高，与模型组比，TSF1-M，TSF2-L，TSF2-M及TSF3-L组血清HDL水平显著升高，TSF2-M和TSF3-L血清T-CHO水平显著升高，TSF1-M血清AST水平显著升高，糖肾方3个工艺各剂量和阳性对照药对模型大鼠血清TG、LDL-C和AST水平无显著影响（表2）。

2.6 实验组大鼠肾组织病理变化

正常对照组肾小球结构清晰，未见系膜基质增生，肾小管结构正常，排列整齐，模型组肾脏明显增大，肾小球内系膜基质中度增生，部分区域出现局灶性肾小球硬化，肾小管上皮细胞呈现玻璃滴样病变和空泡变性，部分区域出现肾小管扩张、萎缩及坏死。间质散在淋巴细胞和单核细胞浸润及纤维化，TSF1-M组和阳性药对照组肾小球及小管间质病变与模型组比明显改善，TSF1-L组与TSL1-H组肾小球系膜轻度增生，肾小管部分区域有扩张，个别区域有坏死，TSF2-L组、TSF2-M组、TSF2-H组肾组织病变程度在正常对照组和模型组之间，TSF3-L、TSF3-M、TSF3-H组肾小球系膜基质增生程度与模型组相比无明显改善，且TSF3-M、TSF3-H组肾小管间质损害如炎细胞浸润、小管扩张程度较模型比更为严重（图4，见封底）

表1 糖肾方不同提取工艺对肾功、TP和ALB的影响

表2 糖肾方不同提取工艺对血脂及肝功的影响

3 讨论

糖肾方作为本课题组研制的治疗DN中药复方，多中心RCT临床试验和动物实验的研究中已证实了其疗效[2，3]。然而，在开展了成药性研究中发现：采用传统水提工艺的糖肾方出膏率较高，在制剂和毒理研究中也会存在服用量大、给药困难等问题。文献研究发现，黄芪、生地、山茱萸中的多糖类成分是本方出膏率高的主要因素，而三七总皂苷和山茱萸的环烯醚萜总苷改善DN作用明显[4，5]，大黄中的蒽醌类成分如大黄酸等对DN具有肾保护作用[6]，但该类成分也存在肝肾毒性等问题[7]，上述成分醇提溶出率高，且可降低出膏率。因此在工艺研究中设计了部分药味醇提的2种工艺，并与水提工艺进行药效比较，以期获得最佳提取工艺。

DN研究中由于糖尿病引起模型动物肾损害较为缓和，且病程较长，单侧肾切除可加速DN病程及加重肾脏病理改变[8]，是一种较为理想的DN药效学评价模型。本研究利用单侧肾切合并STZ注射诱导大鼠高血糖12周后，尿白蛋白肌酐比值较正常对照组升高了约20倍，出现肾小球系膜基质增生、肾小管扩张、萎缩及间质纤维化等病理改变，表明模型建立成功。在此基础上进行了糖肾方不同提取工艺的药效学比较。结果表明工艺1中剂量在降低尿白蛋白排泄和改善肾病理损伤效果最为显著，且显著升高模型大鼠血清HDL-C水平，提示其也有改善脂代谢异常的作用。而高剂量组药效较差，未显示量效相关性。一方面可能由于高剂量糖肾方给药量过大，影响了大鼠食欲与状态，另一方面其ALT显著升高，提示高剂量的工艺1可能损伤了肝功能，引起药物代谢动力学改变，影响药效发挥。工艺2对尿白蛋白和肾损害也表现出改善的趋势，但不及工艺1。有报道黄芪多糖和地黄多糖具有减轻DN的活性[9，10]，黄芪中的皂苷[11]、地黄中的梓醇[12]以及枳壳中的柚皮苷[13]、橙皮苷[14]对DN也有肾保护作用，醇沉工艺除去了大部分多糖，也引起上述成分含量降低，可能与其药效降低有关。研究还发现工艺3甚至还有加重肾损伤的趋势，这可能与大黄醇提后蒽醌类溶出增加，后者引起肾毒性所致[15]。

综上所述，采用传统水提的工艺1，在改善DN模型大鼠肾组织病理损害、减少尿白蛋白排泄方面药效显著优于工艺2和工艺3，为最佳提取工艺，因此，下一步研究将以水提工艺为基础，对其不同组分进行药效学评价，为将其开发为药效成分明确、质量可控、安全有效的中药新药奠定基础。

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