抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对结肠炎小鼠结肠NF-κB、IκB表达的影响▲

唐光耀 张启芳 王柏涛 唐澄海 孟云超 李西融 张海莲 张 晶

(1 桂林医学院研究生学院，广西桂林市 541004；广西壮族自治区南溪山医院2消化内科，3 病理科，桂林市 541002)

抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对结肠炎小鼠结肠NF-κB、IκB表达的影响▲

唐光耀1张启芳2*王柏涛1唐澄海3孟云超2李西融3张海莲2张 晶3

(1 桂林医学院研究生学院，广西桂林市 541004；广西壮族自治区南溪山医院2消化内科，3 病理科，桂林市 541002)

目的 探讨抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对结肠炎小鼠结肠NF-κB p65、IκBα表达的影响。方法 采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导制备小鼠急性溃疡性结肠炎(UC)的模型，应用抗MIF单抗干预，观察抗MIF单抗对小鼠UC发病的干预作用。该实验分为正常对照组、UC模型组、抗MIF单抗干预组和生理盐水组。造模及药物干预期间观察小鼠一般情况并行疾病活动指数(DAI)评分，第8天断颈处死全部小鼠，行结肠大体损伤评分，HE染色光镜下观察结肠病理改变，免疫组化染色观察NF-κB p65、IκBα在结肠组织炎症细胞的表达情况。结果 与正常组相比，UC模型组中NF-κB p65的表达显著增加，而IκBα的表达稍增加，在抗MIF单抗治疗后，NF-κB p65的水平明显低于UC模型组，并且IκBα含量增高。结论 抗MIF单抗对DSS诱导的急性UC的小鼠具有保护作用，减低了小鼠结肠组织NF-κB p65的表达水平，提高IκBα的表达水平，从而达到抑制UC小鼠结肠组织NF-κB通路的过度激活的作用。

抗巨噬细胞移动抑制因子单抗；葡聚糖硫酸钠(DSS)；溃疡性结肠炎(UC)；核因子-κB(NF-κB)；NF-κB抑制蛋白(IκB)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性自身免疫性疾病，主要累及结肠黏膜及黏膜下层，其病因及病理机制尚未清楚阐明[1]。许多动物实验和临床研究证实其发病与免疫异常密切相关[2]。近年来生物治疗解决了部分患者的病痛，但仍然存在较多的问题。因此，寻找更多的治疗途径尤其重要。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种具有多种生物功能的前炎症因子，主要抑制巨噬细胞的游走，促使活化免疫细胞和巨噬细胞分泌多种炎症因子，参与免疫与炎症疾病的进展[3]。最近研究已证实MIF在UC的发生发展中起着重要作用，但其具体分子机制尚未阐明[4]。NF-κB作为一种多向性、多功能的核转录因子，作用于靶细胞分泌多种炎症因子[5]。研究发现其在UC的发病中起重要作用，并且NF-κB在UC患者肠黏膜中表达增加[6]。因此，本实验通过DSS诱导建立急性UC模型，从而观察应用抗MIF单抗后小鼠的外部变化，并且通过检测结肠组织的NF-κB活化水平及其抑制因子的表达水平，评价抗MIF单抗是否能抑制NF-κB通路的激活从而缓解小鼠结肠炎的发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级雄性BALB/c小鼠40只，鼠龄8～9周，体质量(24±2)g，购自湖南斯莱克景达实验动物公司(许可证号码：SCXK湘 2011-0003)。进行适应性喂养7 d后，随机分为正常对照组、UC模型组、抗MIF单抗干预组、生理盐水组，每组10只。

1.2 药品与设备 ①药品准备：抗MIF单抗，购自重庆探生科技有限公司(批号：FAB 20140001)；Anti-NF-κB p65抗体购自英国abcam公司(批号：GR200963-5)；Anti-IKB alpha抗体购自英国abcam公司(批号：GR111613-8)；葡聚糖硫酸钠(DSS，MW 36000～50000)，购自美国MP Biomedicals生物医学公司(批号：000452423)；二抗HRP鼠兔通用型，购自北京中杉金桥生物技术有限公司(批号：K152318A)；②设备准备：液氮罐(乐山市东亚机电工贸有限公司)；冰箱(青岛海尔公司)；-80℃超低温冰箱(德国Thermo公司 )；电子称ACS-D11(上海三峰)；制冰机FM-130(北京长河流科学仪器公司)；精密天平ML4002(德国梅特勒-托利多)；微量移液器1 000 μL(百得)；微量移液器100 μL(赛默飞世尔科技)；微量移液器10 μL(德国Eppendorf)；小鼠解剖器械套件(美国哈佛仪器)；电热恒温水浴箱；石蜡自动包埋脱水机；石蜡切片机；光学显微镜显微摄像系统；日本 Olympus 数码相机。

1.3 模型制备及药物干预 正常对照组自由饮水 7 d，其余三组建立溃疡性结肠炎模型采用自由饮用5% DSS溶液7 d。抗MIF单抗(4 mg/mL)与生理盐水1 ∶3体积比稀释后，抗MIF单抗干预组与生理盐水组于1 d、2 d、4 d、6 d，分别行腹腔注射抗MIF单抗和生理盐水0.2 mL·只-1·d-1。造模及给药期间，每天观察并记录各组小鼠精神状态、皮毛、活动、饮食、体重变化、粪便性状等情况，并根据Cooper的经典评分方法[7]，进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分。

1.4 标本收集与处理 第8天用颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹暴露结肠，截取盲肠末端至肛门的整个肠段，沿肠系膜缘纵轴切开，预冷生理盐水冲洗干净肠内容物后，在滤纸上将肠壁展开，肉眼观察结肠标本的炎症和溃疡情况，对结肠进行大体损伤评分[8]。一部分在液氮中速冻后保存于-80℃冰箱中，另一部分在HE染色镜下观察各组小鼠结肠组织病理改变并行组织学损伤评分[9]；免疫组化染色镜下观察NF-κBP65、IκBα的表达水平,一抗稀释浓度依次为1 ∶500、1 ∶600。阳性结果判断：高倍镜下选取3个不重叠视野，以胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，计数各视野阳性细胞率(阳性细胞数/该视野细胞总数×100%)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行分析处理，计量资料以(x±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般情况 正常对照组小鼠精神较好，皮毛有光泽、顺滑，反应迅捷，体重均不同程度增加，粪便成条形、大便未见血性样；与正常对照组比较，UC模型组和生理盐水组小鼠皮毛明显凌乱、无光泽，严重者毛发干枯，反应迟滞，活动度明显减低，出现拱背、扎堆现象，体重明显下降，粪便稀样、次数增多、便血严重；抗MIF单抗干预组小鼠毛色较正常对照组略黯淡，部分稍显杂乱，但不如模型组和生理盐水组明显，精神状态良好，体重减轻幅度小，部分小鼠出现轻微便血现象。

2.2 小鼠DAI评分 观察每日小鼠的体重、大便性状和隐血情况。疾病的活动情况与DAI评分成正比。与正常对照组相比，其余三组差异有统计学意义(P<0.05)，表明模型制备成功；与抗MIF单抗干预组相比，UC模型组和生理盐水组与其差异均具有统计学意义(P<0.05)；而UC模型组和生理盐水组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 结肠大体损伤评分 肉眼观察正常对照组小鼠结肠未见水肿充血，未见糜烂、溃疡，肠壁血管清晰，均匀光滑；模型组和生理盐水组结肠充血水肿、肠壁僵硬、色泽晦暗，散在出现明显出血点和溃疡，伴有糜烂，与周围组织粘连；抗MIF单抗干预组小鼠结肠肠壁色泽暗淡，充血水肿，出现微小出血点，但其程度、范围、溃疡个数均不及模型组和生理盐水组显著。见表1。

2.4 HE染色组织学评分 正常对照组小鼠结肠黏膜及黏膜下层结构完整无缺损，上皮细胞排列整齐，腺体形态规则，浆膜层血管无充血现象；UC模型组结肠黏膜上皮糜烂严重，黏膜固有层大部分腺体结构破坏，肉芽组织形成，提示可能曾存在浅溃疡，黏膜固有层及黏膜下层被大量炎症细胞浸润；抗MIF单抗干预组结肠黏膜上皮无糜烂，腺体结构正常，血管内红细胞聚集，呈充血现象，黏膜固有层炎症细胞浸润，但炎症细胞数量及浸润深度不及UC模型组和生理盐水组；生理盐水组结肠黏膜上皮缺损、断裂，轻度糜烂，炎症细胞主要集中在黏膜固有层。见图1、表2。

表1 小鼠DAI评分及结肠大体损伤评分 (x±s，分)

注：*P<0.05；与UC模型组比较，#P<0.05；与抗MIF单抗干预组比较，▲P<0.05。

A 正常对照组

B UC模型组

C 抗MIF单抗干预组

D 生理盐水组

2.5 免疫组化SP法检测小鼠结肠组织NF-κB p65的表达 小鼠结肠NF-κB p65主要表达于黏膜上皮、单核细胞及巨噬细胞，正常对照组结肠黏膜炎症细胞少量表达在胞质内，而在UC模型组和生理盐水组中，结肠黏膜炎症细胞均呈强表达，胞核为主；抗MIF单抗干预组中结肠黏膜炎症细胞表达减少，表达在胞质内。

NF-κB 的激活途径可通过降解IκBs的方式来活化NF-κB， 活化的NF-κB随后进入细胞核内与DNA结合。由此可知，NF-κB出现核转移是其激活的一种重要指标。实验结果发现，与对照组相比，实验组中NF-κB被激活，大量的NF-κB进入核内，从而导致细胞核内NF-κB的含量增加；抗MIF单抗干预组中细胞核内NF-κB含量降低，大量NF-κB滞留在细胞质中。模型组NF-κB持续激活，大量NF-κB进入到细胞核内。单抗组解除了对IκB表达的抑制，IκB和NF-κB结合滞留在细胞质中。我们发现UC模型组中NF-κB p65的表达细胞数显著性增加(与对照组比较，差异有统计学意义，P<0.01)，而给予抗MIF单抗治疗后NF-κB p65结果降低(与UC模型组比较，差异有统计学意义，P<0.01)，从而缓解炎症发展。见图2、表2。

A 正常对照组 B UC模型组 C 抗MIF单抗干预组 D 生理盐水组

2.6 免疫组化SP法检测小鼠结肠组织IκBα的表达 IκBα在各组小鼠结肠上皮组织中均不表达，但在炎症细胞中表达。对照组结肠IκBα在黏膜炎症细胞的胞质中表达，并且在黏膜、黏膜下层及固有层的炎症细胞中均有表达；而在UC模型组和生理盐水组中，小鼠结肠黏膜的炎症细胞表达增加，IκBα在结肠组织中的表达稍增加(与对照组比较，差异性有统计学意义，P<0.05)；抗MIF单抗组中结肠黏膜炎症细胞表达减少，IκBα在结肠组织中的表达也显著增多(与模型组比较，差异有统计学意义，P<0.05)。见图3、表2。

A 正常对照组 B UC模型组 C 抗MIF单抗干预组 D 生理盐水组

组别n阳性细胞率病理学评分NF⁃κBIκB正常对照组100．3±0．48#▲8．93±1．91#▲9．13±1．98#▲UC模型组1013．6±1．17∗▲58．63±2．41∗▲13．23±2．11∗▲抗MIF单抗干预组106．3±1．16∗#25．40±2．46∗#31．80±2．09∗#生理盐水组1013．9±1．52∗▲58．23±2．76∗▲13．60±1．96∗▲

注：*与正常对照组比较，P<0.05；与UC模型组比较，#P<0.05；与抗MIF单抗干预组比较，▲P<0.05。

3 讨 论

随着经济的发展，生活和饮食习惯的改变，近10年来我国UC发病率逐年升高[10]。随着抗TNF-α类新型制剂的成功运用[11]，尝试使用生物制剂治疗UC减轻炎症程度已成为当前基础与临床研究领域的热点和突破点。典型的NF-κB是p50和p65构成的异源二聚体，可通过调控多种基因的表达，从而参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程中[12]。其次，NF-κB激活通路多种，其中最经典的通路是通过降解IκBs释放NF-κB进入细胞核内，结合目的基因促进其翻译转录[13]。NF-κB通路的过度激活导致了IBD的发生和发展。

本实验通过DSS诱导制备小鼠急性UC模型，通过对小鼠DAI评分及结肠大体及组织损伤的观察，确立UC模型的成功建立。研究发现，应用抗MIF单抗的小鼠，较模型组而言，小鼠的体重减轻幅度、粪便性状、结肠的大体损伤、光镜下结肠组织病理改变等均有显著改善，结果表明抗MIF单抗能有效地减轻DSS诱导的急性UC小鼠的外在表现及结肠大体及组织的损伤，有一定的治疗作用，对UC小鼠有一定的保护作用。本实验进一步通过免疫组化SP法检测小鼠结肠组织NF-κB p65及其抑制因子IκBα的表达，结果显示抗MIF单抗组小鼠结肠组织的NF-κB p65的表达较模型组减少，而IκBα较模型组的表达增多，两者比较具有显著性差异。研究结果表明抗MIF单抗对小鼠UC的发病的确能起到一定的保护作用。我们知道，NF-κB的核转移是其激活的一个重要指标，通过免疫组化结果，我们发现UC模型组中细胞核NF-κB p65的表达量明显高于细胞质表达。这提示模型组NF-κB持续激活，大量NF-κB进入到细胞核内，从而促进NF-κB的过度活化，加速炎症反应的进程。在抗MIF 单抗治疗组中，抗MIF单抗促进IκBα的表达量，从而导致NF-κB与IκB结合滞留于细胞质中，最终缓和炎症的发生。

近年来在对UC发病机制的研究中发现，UC患者NF-κB的活性显著升高，特别是活动期UC病人，肠黏膜的基底膜巨噬细胞和上皮细胞中的p65亚基表达明显升高[14]。NF-κB的P65亚基和细胞质抑制性蛋白IκBs(IκBα、IκBβ、IκBε)结合后遮蔽NF-κB的核定位信号，阻止NF-κB向核内转移与核内κB转录位点结合[15]。MIF 启动子上有NF-κB 的转录结合位点，其表达受到NF-κB信号通路的调控，研究发现IL-1β能通过NF-κB途径诱导离体子宫内膜细胞中MIFmRNA的表达及蛋白的分泌。MIF 又可间接促使移入核内的NF-κB增多，激活NF-κB的活性[16]。IκBα的降解与低表达是NF-κB活化的关键步骤。在以往研究中发现MIF可以抑制蛋白IκB的产生，使移入核内的NF-κB增多，结合相应基因的核转录结合位点，启动mRNA转录，增加翻译产物，从而释放大量黏附分子和炎性因子[17]。MIF与NF-κB互相促进表达，形成正反馈，由此产生级联反应,使机体内炎症因子失衡。

本实验通过免疫组化SP法检测小鼠结肠组织的NF-κB p65、IκBα的表达，发现应用抗MIF单抗的小鼠，较UC模型组而言，其中NF-κB p65表达下降，抑制IκBα因子表达增加。结果表明使用MIF单抗解除对IκB抑制，IκB表达增多并与NF-κB结合，同时减少了NF-κB的向核内转移，间接证明了MIF单抗阻断了NF-κB通路的过度激活，NF-κB作为信号传导途径中的枢纽，抑制了炎症细胞的细胞因子表达，减轻了肠道炎症反应。

本次实验从分子信号转导通路层面对抗MIF单抗对小鼠溃疡性结肠炎可能产生的干预作用进行了探讨，初步判定抗MIF单抗通过抑制NF-κB信号通路及其下游炎症因子的表达发挥作用 ，经实验证实了MIF单抗的疗效，减轻了炎症。希望在进一步的研究中能确定NF-κB向核内转移后NF-κB核细胞的阳性率，且能定量研究NF-κB的活化情况。

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Effect of anti-macrophage migration inhibitory factor on NF-κB、IκB Expression in mice with ulcerative colitis

TANGGuangyao1，ZHANGQifang2,WANGBaitao1,TANGDenghai3,MENGYunchao2,LIXirong3,ZHANGHailian2,ZHANGJing3

(1GraduateSchoolofGuilinMedicalCollege，Guilin,Guangxi541004China；2DepartmentofGastroenterology; 3DepartmentofPathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Guilin541002)

Objective To investigate the effect of anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody on NF-κB p65、IκBα expression in mice with ulcerative colitis. Methods Acute ulcerative colitis was induced by 5% dextran sulfate sodium(DSS). Then the protective effect of anti-MIF Ab on ulcerative colotis in mice was observed. Forty mice were randomly distributed into normal control group, UC model group, anti-MIF Ab intervention group and saline group.During modeling and the period of administration, to observe score Disease Activity and general situations Index(DAI) of mice, after 8 days killing all mice,performing the gross damage score in colon, observing the colonic histopathological changes under the light microscope on HE staining.The expression of NF-κB p65、IκBα protein was detected by immunohistochemical staining. Results Compared with normal control mice, the level of NF-κB p65 protein increased significantly in colon tissue of mice with UC,the level of IκBα slightly increased. After treatment with anti-MIF Ab , the expression level of NF-κB p65 significantly lower than that in UC model group,but the expression level of IκBα increased. Conclusions These findings suggest that anti-MIF Ab had a protective effect on DSS-induced ulcerative colitis in mice down-regulating NF-κB p65 protein expression. Thus to inhibit the NF-κB signaling pathway, excessive activation in the colon tissue of UC mice.

Macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody(anti-MIF Ab); Dextran sulfate sodium(DSS); Ulcerative colitis(UC); Nuclear factor-κB (NF-κB); Inhibitor of NF-κB(IκB)

广西桂林市科学研究与技术开发计划项目(编号：科技攻关20140120-7-2)；广西医疗卫生重点科研课题(编号：重2011018)

R 574.1

A

1673-6575(2017)02-0170-05

10.11864/j.issn.1673.2017.02.04

2017-01-27

2017-03-25)

*通信作者