不同消毒方式对设施草莓花药愈伤组织诱导的影响

吴鹏飞+王丽娟+刘昭+切岩祥和

摘要：以栽培品种京藏香草莓（Fragaria ananassa Duch.）花药（单核靠边期）为材料，75%乙醇为对照，研究了5种不同组合的消毒方式对草莓花药愈伤组织的诱导影响。结果表明，处理T1经过Tween-80消毒后，用75%乙醇进行消毒30 s可以有效控制花药污染，同时还能减少花药褐化率；其次是处理T3，该处理虽能减少污染，但是褐化率略高于T1；处理T0（CK）、T2均有不同程度的污染，处理T4褐化率最高。

关键词：草莓（Fragaria ananassa Duch.）；花药；消毒方式；愈伤组织

中图分类号：S668.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1364-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.042

Effects of Different Sterilization Methods on Protected Strawberry Anther Callus Induction

WU Peng-fei1， WANG Li-juan1， LIU Zhao1， KIRRIIWA Yoshikazu2

（1.Department of Horticulture， Tianjin Agricultural College， Tianjin 300384，China；

2.Faculty of Agriculture， Shizuoka University， Shizuoka 4228529， Japan）

Abstract： Using varieties of “Jingzangxiang” strawberry（Fragaria ananassa Duch.） anther（mononuclear side） as materials，75% alcohol as a reference， the five different combination ways of disinfection effect on strawberry anther callus induction were studied. The experimental results showed that the treatment T1 after Tween-80 disinfection disinfected with 75% alcohol could effectively control the pollution of anther， at the same time it also reduced the browning rate of anther. T3 could reduce pollution， but the browning rate is slightly higher than the T1， T0（CK） and T2 have different degrees of pollution， T4 browning was the most serious.

Key words： strawberry（Fragaria ananassa Duch.）； anther； disinfection method； callus

草莓（Fragaria ananassa Duch.）為蔷薇科草莓属多年生草本植物，原产南美，中国各地及欧洲等地广为栽培。草莓是高度杂合的多倍体植物，育种上可利用草莓花药组织培养进而获得单倍体植株，经染色体加倍形成纯合二倍体[1，2]，为研究草莓遗传育种提供借鉴。研究表明草莓通过花药组织培养获得的植株脱毒率可达到100%，部分经染色体鉴定后的植株可直接用于生产[3，4]。然而不同的消毒方式对草莓花药的组织培养具有一定影响，不同的消毒试剂、消毒时间等都直接影响草莓花药组织培养，本试验在前人研究的基础上，研究了5种不同组合消毒方式对草莓花药愈伤组织诱导的影响，以期获得最适宜草莓花药组织培养的消毒方式。

1 材料与方法

1.1 试验材料及预处理

以生产上广泛栽培的京藏香草莓花药为试验材料，于2015年12月份采集无病虫害植株的第一花絮的草莓花苞，置于Leica DM4000B正置显微镜下进行镜检，选择单核靠边期的草莓花药于4 ℃冰箱预处理48 h[5]。

1.2 方法

1.2.1 花药消毒 花药消毒设置5个处理（表1）：用洗衣粉对花苞进行表面清洗处理，自来水冲洗20 min。对照组T0（CK），将冲洗好的花苞置于超净工作台中用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4次；处理1（T1），将表面处理过的花苞加入一滴Tween-80摇匀静止5 min，然后自来水冲洗20 min，转入超净工作台中用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4次；处理2（T2），将冲洗好的花苞置于超净工作台中用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4次，加入0.1% HgCl2消毒5 min，无菌水冲洗4次；处理3（T3），用Tween-80对花苞进行消毒后置于超净工作台中用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4次，加入0.1% HgCl2消毒5 min，无菌水冲洗4次；处理4（T4），将冲洗好的花苞置于超净工作台中用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4次，加入2% NaClO消毒5 min，无菌水冲洗4次。

1.2.2 培养基与培养条件 选择饱满的花药（完全去除花丝）接种于愈伤组织诱导培养基上MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，培养基中蔗糖30 g/L，琼脂粉7 g/L，pH 5.8。将接种花药置于（25±1）℃下暗培养3 d[6]，转至光照培养箱，光照时间16 h/d，光照度2 500 lx，湿度65%。

1.3 数据统计

每个处理接种30瓶，每瓶接种10个花药，重复3次，即每个处理共接种300个花药。在接种后每 3 d统计一次污染数（若有污染转接至备用培养基），30 d后统计各处理污染数、褐化数及出愈数。将数据采用Excel和SPSS16.0软件进行数据分析。污染率=污染的外植体数/接种外植体总数×100%；褐化率=（褐化的外植体总数+污染外植体数）/接种外植体总数×100%；出愈率=出愈伤的外植体总数/接种外植体总数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对草莓花药组织培养污染率的影响

由表2可知，不同消毒处理对草莓花药组织进行消毒后，一定程度上可减少组织培养中的污染率，其中T1、T3处理可以显著降低污染率，其次是T2、T4，T0（CK）处理效果最差。

2.2 不同消毒处理对草莓花药组织培养褐化率的影响

由表3可知，T1处理能够显著降低草莓花药组织培养中的褐化率，其次是T2、T3，其中T3处理污染率最低，但是随着加入0.1% HgCl2进行消毒会增加花药的褐化率；在各处理中T0（CK）、T4褐化最严重。

2.3 不同消毒处理对草莓花药组织培养愈伤组织诱导率的影响

由表4可知，T1处理草莓花药愈伤组织诱导率最高，T0（CK）、T2、T3、T4较T1处理愈伤组织诱导率低，其中T0（CK）处理只用75%乙醇进行表面处理不能彻底消毒；在进行花药预处理的过程中，花苞会有不程度开放，此时75%乙醇进行消毒后继续用0.1% HgCl2、2% NaClO消毒会增加草莓花藥的褐化率影响愈伤组织诱导率[7]。

3 小结与讨论

通过花药组织培养获得的单倍体植株，对诱变育种和突变遗传研究具有很高的价值，单倍体材料能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可以为育种生产提供新的遗传材料。提高草莓花药愈伤组织的诱导率，除了对草莓花药进行不同发育期的选择、低温预处理、不同培养基的筛选外，如何对草莓花药进行有效地表面消毒直接关系到愈伤组织诱导率[8，9]。本试验对5种消毒试剂进行筛选的过程中发现，T1处理中使用Tween-80进行清洗后，加入75%乙醇消毒可以显著降低花药的污染率，而且能够降低草莓花药的褐化率；T2、T3、T4经75%乙醇消毒后分别用0.1% HgCl2、2% NaClO进行处理可以显著减少污染的发生[10，11]，但是随着花药预处理过程中花苞的不同程度开放，继续使用HgCl2和NaClO消毒会在一定程度上增加草莓花药诱导的褐化率。

结果表明，用洗衣粉对花苞进行表面清洗后，用Tween-80浸泡冲洗后加入75%乙醇灭菌30 s能够降低草莓花药组织培养过程中的污染率和褐化率，该试验结果可以为草莓花药组织培养提供一定参考。

参考文献：

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