蛹虫草基质多糖对传染性支气管炎病毒感染鸡免疫指标的影响

周梅仙+周业飞

摘要：试验应用滴鼻+点眼法对7日龄黄羽肉鸡攻毒建立传染性支气管炎感染模型，采用蛹虫草基质多糖进行治疗试验，通过对肉鸡免疫器官指数、外周血淋巴细胞增殖指数、血清抗体水平和γ-干扰素浓度的检测来研究蛹虫草基质多糖用于防治鸡传染性支气管炎的可能性。结果表明，蛹虫草基质多糖能夠促进肉鸡法氏囊和脾脏的生长发育，加快其增重，从而提高免疫器官指数，又能促进外周血淋巴细胞增殖转化水平；同时还能使血清抗体水平和γ-干扰素浓度升高，增强机体的免疫力。因此，蛹虫草基质多糖可作为鸡传染性支气管炎防治的临床候选药物。

关键词：蛹虫草基质多糖；传染性支气管炎病毒；免疫指标；临床疗效

中图分类号：S831.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1298-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.024

Effects of Polysaccharides from Cordyceps militaris Stroma on Immunity of Chicken Infected by Infectious Bronchitis Virus

ZHOU Mei-xian，ZHOU Ye-fei

（Department of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing 211171， China）

Abstract：Seven-day-age broilers artificially infected by infectious bronchitis virus via nasal dripping and eye dropping were used for treatment test. Cordyceps militaris stroma polysaccharides were fed to broilers，and indices of immune organs，indices of lymphocyte stimulating transform，antibody level and interferon-γ concentration were investigated respectively. The results showed that C. militaris stroma polysaccharides could promote growth and development of broiler bursa of fabricius and spleen，and increase indices of immune organs，and also could promote lymphocyte transform causing increased levels of antibody and promote the concentrations of interferon-γ resulting in improving immunity potential. It was conducted that C. militaris stroma polysaccharides could be used for clinical treatment of chicken infected by infectious bronchitis virus.

Key words：Cordyceps militaris stroma polysaccharides； infectious bronchitis virus； immune index； clinical treatment

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染性疾病[1]。近年来，IB对养鸡业（特别是商品肉鸡）的危害日益严重，给养鸡业造成了巨大的经济损失[2]。目前在临床上对该病防制的主要措施是采用接种疫苗的方法，具有显著免疫效果的主要是H120和H52株弱毒疫苗，但由于IBV很容易通过基因突变、缺失、插入和重组发生变异，致使临床上仍经常发生IBV的感染[3]。

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北冬虫夏草或北虫草，隶属于子囊菌门麦角菌科虫草属的真菌[4]。目前，市场上销售的蛹虫草大多采用大米、小麦、蚕蛹等培养基进行人工栽培，当蛹虫草子实体被采摘后，大多剩余的基质常被当作废弃物，没有得到进一步的利用，而研究表明废弃基质中的多糖含量为蛹虫草子实体的2～4倍[5]。前人研究表明蛹虫草子实体多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、延缓衰老等功效[6]。为了研究废弃的蛹虫草基质多糖是否也具有类似的临床功效，试验以兽医临床实际需要为出发点，将蛹虫草基质多糖应用于人工感染IBV鸡的防治，并从免疫器官指数、外周血淋巴细胞增殖刺激指数、血清抗体水平和γ-干扰素浓度等指标来评价蛹虫草基质多糖的临床疗效，从而为扩大蛹虫草基质多糖的应用范围提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 蛹虫草基质多糖的制备

根据文献[7]略有改进，将采完蛹虫草子实体后的废弃基质，烘干粉碎40目过筛后用乙醚脱脂，60 ℃干燥至恒重，称取5 g加入200 mL去离子水，摇匀后加入2 000 U的纤维素酶2.5 mL，调节pH至4.8；50 ℃水浴1.5 h后转移到80 ℃水浴中灭活2 h；最后进行超声波处理，30 ℃处理40 min后4 200 r/min离心10 min，弃去沉淀，收集上清液。应用旋转蒸发仪将上清液旋转蒸发到一定体积，用Sevag法除蛋白后采用4倍体积的95%乙醇在4 ℃冰箱中醇沉24 h，最终通过冷冻干燥得到蛹虫草基质多糖粗制品，-20 ℃保存备用。

1.2 鸡胚、试验动物和病毒毒株

150只7日龄IBV非免疫雏鸡，由江苏省海安县双效种禽有限责任公司孵禽场提供；试验所用的攻毒毒株传染性支气管炎病毒M41株，由江苏省生物教学示范中心保存提供，按常规方法，经9～10日龄SPF鸡胚增殖一代而获得，SPF鸡胚由南京天邦生物科技有限公司提供。

1.3 主要试剂

淋巴细胞分离液为美国贝克曼库尔特有限公司产品；RPMI1640固体粉状培养基（Gibco公司），根据说明书要求用去离子水配制，然后加入双抗（青、链霉素各100 U/mL），临用前加入10%的小牛血清（赛齐（上海）生物工程有限公司）作为细胞培养生长液；四甲基偶氮唑蓝（MTT，噻唑蓝，Amresco公司）溶液和ConA（Sigma公司），分别配制成5 mg/mL和1 mg/mL的溶液，0.22 μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤，分装备用；RNA提取试剂盒TRIzol Regeant购自Invitrogen公司；反转录酶M-MLV为Promega公司产品；DEPC水为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；二甲亚砜（DMSO）、乙醇、异丙醇和氯仿等其他试剂均为分析纯。

1.4 动物分组及处理

150只7日龄IBV非免疫雏鸡随机分为5组，每组30只，设3个蛹虫草基质多糖治疗组（高、中、低剂量分别为试验1组、试验2组、试验3组）、空白对照组和病毒对照组。除空白对照外其他各组分别通过滴鼻+点眼方式接种IBV 0.2 mL，每日观察，待各组出现明显的传染性支气管炎病毒感染症状后，治疗组分别通过饮水方式饲喂不同剂量的蛹虫草基质多糖，按每次1 mL/只，每天1次，连续给药5 d，给药后第7天开始采样。

1.5 免疫器官指数的测定

分别在21、24、27、30、33日龄时每组随机取6只鸡，称重，翅静脉采血后处死，剖检采集法氏囊和脾脏，称重，记录数据，计算法氏囊免疫指数和脾脏免疫指数。计算公式为法氏囊免疫指数=法氏囊质量（g）/体重（kg），脾脏免疫指数=脾脏质量（g）/体重（kg）。

1.6 鸡淋巴细胞（PBMC）增殖试验

1.6.1 鸡外周血淋巴细胞的制备 从鸡翅静脉无菌取1 mL血液，小心沿侧壁加入到含有4 mL淋巴细胞分离液的玻璃离心管中液面上，以2 000 r/min离心15 min；收集上层与淋巴细胞分离液（下层）两相界面上的细胞（白色云雾层），放入新的10 mL玻璃离心管中，并以无菌PBS缓冲液补至总体积8 mL，混匀后，再以2 000 r/min离心10 min；吸去上清液，细胞沉淀经PBS反复洗涤2次，即得所需要的外周血淋巴细胞；经过活细胞染色计数之后，用 RPMI-1640完全营养液调节细胞密度至5×106 个/mL；按100 μL/孔将细胞悬液加到96孔细胞板中培养备用。

1.6.2 淋巴细胞增殖试验 淋巴细胞增殖试验按Jiang等[8]的方法稍作调整。将蛹虫草基质多糖作为刺激原，每孔加入100 μL，对照孔加入100 μL RPMI-1640完全营养液，阴性对照孔为PBS，阳性对照孔为ConA（终浓度为10 mg/L），各做3个重复孔。37 ℃下培养44 h后每孔加入40 μL MTT（5 mg/mL），37 ℃下继续培养4 h。吸弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡融解结晶沉淀，在酶标仪上测定OD570 nm值，计算刺激指数（刺激指数SI=刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值）。

1.7 血清IBV抗体和IFN-γ浓度的检测

将翅静脉采集的血样分离血清后，用HI微量法检测接种鸡血清样品中的抗体效价。IFN-γ浓度的测定具体操作方法参照鸡IFN-γ酶联免疫分析试剂盒说明书进行，酶联免疫分析试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.8 数据处理与统计分析

应用SPSS软件对数据进行统计分析，并进行ANOVA及Duncans多重分析，比较各组差异，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草基质多糖对鸡免疫器官指数的影响

在正常生理情况下，免疫器官的状态及机能强弱直接决定着机体的全身免疫水平，免疫器官指数越大其免疫功能越强。从表1和表2可看出，蛹虫草基质多糖中剂量组从24日龄开始，法氏囊和脾脏免疫指数与病毒对照组差异显著（P<0.05），其余各组差异不显著，说明蛹虫草基质多糖中剂量组能明显促进法氏囊和脾脏的生长发育与成熟，但至33日龄差异却不显著，提示蛹虫草基质多糖除了具有一定的剂量效应，还有一定的时效性。

2.2 蛹虫草基質多糖对鸡PBMC的增殖效应

通过MTT法测定了蛹虫草基质多糖对鸡淋巴细胞（PBMC）增殖效果，具体见图1。由图1可见，蛹虫草基质多糖中剂量组SI值在30和33日龄显著高于病毒对照组和空白对照组（P<0.05），其余各组间差异不显著。

2.3 蛹虫草基质多糖对鸡血清抗体效价的影响

用HI微量法对所采集的免疫鸡群的血清样品进行IBV抗体检测，结果见表3。从表3可以看出，IBV血清抗体在27、30和33日龄时，蛹虫草基质多糖中剂量组比病毒对照组提高了1.5、1.4和1.7个滴度，差异显著（P<0.05），其余各组间无显著差异，表明一定剂量的蛹虫草基质多糖对鸡群抗体免疫力具有显著影响。

2.4 蛹虫草基质多糖对鸡血清γ-干扰素（IFN-γ）浓度的影响

从图2可以看出，蛹虫草基质多糖中剂量组血清中γ-干扰素的浓度在30和33日龄时显著高于病毒对照组和空白对照组（P<0.05），其余各组间差异不显著。说明一定剂量的蛹虫草基质多糖能有效促进鸡体内γ-干扰素的分泌。

3 小结与讨论

免疫器官是动物实现免疫功能以及免疫活性细胞发育、增殖的场所，通常分为中枢和外周免疫器官两部分，法氏囊是鸟类动物所特有的主导机体体液免疫的中枢器官，是驯化B淋巴细胞发育成熟的场所[9]。脾脏是体内形体最大的外周免疫器官，结构类似淋巴结，是T、B淋巴细胞定居和抗原刺激进行免疫应答的重要基地，也是能够进行体液免疫和细胞免疫的场所[10]。在机体免疫功能评价中，免疫器官指数常作为一种辅助性检测手段，其结果可从侧面反映出机体免疫器官的发育状况与机体的免疫功能[11]。免疫器官指数数值升高则说明动物机体免疫器官发育成熟较快，动物机体免疫功能增强[12]。在本试验过程中，试验鸡在饮用一定剂量的蛹虫草基质多糖后，法氏囊和脾脏的免疫器官指数数值均显著高于病毒对照组，表明一定剂量的蛹虫草基质多糖可以促进动物机体免疫器官的生长发育与成熟，从而提高机体的免疫力和抗IBV感染能力。

鸡被感染IBV后，在动物机体内可形成IBV抗原特异性的T淋巴细胞抗原识别系统，同时还能通过产生记忆效应的淋巴细胞进行机体的免疫应答，且鸡体内T淋巴细胞增殖与对IBV的抗感染呈正相关[13]。在本试验中，饮用一定剂量的蛹虫草基质多糖后，试验鸡T淋巴细胞增殖转化率显著高于病毒对照组，说明一定剂量的蛹虫草基质多糖可促进感染鸡外周血中淋巴细胞增殖转化，增强动物机体的细胞免疫功能，同时在本试验中还发现一定剂量的蛹虫草基质多糖能显著提高感染鸡血清中的抗体效价水平，这些结果显示一定剂量的蛹虫草基质多糖能在临床上更好地发挥抗病毒作用。

通过对动物机体细胞因子的定量检测，不仅有助于了解动物机体的免疫功能状态，而且能对动物感染疾病的治疗和预后有重要的指导作用[14]。γ-干扰素是I型辅助T细胞（Th1细胞）的标志性细胞因子，是一种广谱抗病毒生物制剂，它的作用机制是不直接杀伤或抑制病毒本身，而是通过与易感细胞表面受体作用，从而使易感细胞产生抗病毒蛋白来抑制病毒的生长与复制，同时在动物机体内还能起到免疫调节作用，进一步增强动物机体抗病毒能力[15]。本试验中一定剂量的蛹虫草基质多糖组中γ-干扰素血清浓度显著高于病毒对照组和空白对照组。

目前，在养殖场暴发大规模的IB这类病毒性疾病疫情，临床上的治疗多采用特异性卵黄抗体或高免血清进行紧急免疫接种，虽然取得了一定治疗效果，但存在很多不足[16]。本试验的结果表明一定剂量的蛹虫草基质多糖可促进机体免疫器官生长发育，增强淋巴细胞增殖转化，提高机体抗体水平和γ-干扰素浓度，增强机体抗病毒感染的能力，因此，在临床中蛹虫草基质多糖可作为IB这类病毒性疾病防治的候选药物。

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