松墨天牛分子生物学研究综述

刘琪司+陈敬祥+林同

摘要：松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）是危害马尾松等林木的重大森林害虫，是松材线虫的主要传播媒介。从松墨天牛的分子生物学基础研究、分子分类及鉴定、cDNA文库与转录组的构建、基因克隆、药剂胁迫对基因表达的影响等5个方面综述其在分子生物学领域的最新进展，以促进松墨天牛基础研究，并为探索松墨天牛安全有效的防治方法提供参考。

关键词：松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）；分子生物学；基因克隆；基因表达；农药胁迫

中图分类号：S763.38；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1201-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.001

Reviews on Molecular Biology of Monochamus alternatus Hope

LIU Qi-si， CHEN Jing-xiang， LIN Tong

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract： Monochamus alternatus is a major forest pest that damages trees such as Pinus massoniana and is the main medium of pine wood nematode. In the paper，the latest progresses in the field of molecular biology were reviewed from five aspects including fundamental research of molecular biology，molecular classification and identification，construction of cDNA library and transcriptome analyses，gene cloning and insecticides stress on gene expression of M. alternatus et al，which may provide new references for fundamental research and the control of M. alternatus.

Key words： Monochamus alternatus Hope； molecular biology； gene cloning； gene expression； pesticide stress

松墨天牛（Monochamus alternatus Hope），又名松褐天牛、松天牛，隸属于鞘翅目（Coleoptera）天牛科（Cerambycidae）沟胫天牛亚科（Lamiinae），分布于中国的西藏自治区以东，河北省以南、东至台湾省、南至广东省区域；国外分布于日本、朝鲜、老挝等[1]。主要危害马尾松（Pinus massoniana）、油松（P. tabulaeformis）、黑松（P. thunbergii）等生长衰弱的树木或新伐倒树木[2]，是中国南方松林的重要蛀干害虫。同时，它又是松树毁灭性病害松材线虫[Bursaphelenchus xy-lophilus（Steiner et Buhrer） Nicle]的主要媒介昆虫。在日本和中国，该病虫主要通过羽化后的松墨天牛成虫补充营养和产卵时造成的伤口侵入健康树木进行自然传播，给松树造成重大损失[3，4]。因其为害严重且防治困难已被许多国家列为检疫对象。近年来，松墨天牛分子生物学研究进展迅速，新的研究成果不断涌现，本文综述近3年来松墨天牛分子生物学研究的最新进展，以促进松墨天牛基础研究，并为探索松墨天牛安全有效的防治方法提供参考。

1 分子生物学基础研究

1.1 松墨天牛成虫标本保存方法

DNA作为生物体重要的遗传资源，包含着丰富的生物学信息，是生物进化史的重要记录者，获取高质量的基因组DNA是开展任何DNA下游工作的前提和基础。因此，研究昆虫标本的妥善保存方法，以及基因组DNA提取方法，阻止或延缓其基因组DNA的降解，对深入开展其分子生物学研究具有重要意义。曲良建等[5]采用SDS-蛋白酶K消化法对液氮中冷冻保存、无水乙醇-20 ℃冷冻保存、无水乙醇室温保存和干标本室温保存且保存时间在2年以上的松墨天牛成虫标本基因组DNA进行提取，并对不同保存方式提取的DNA样本进行了质量比较和分析。在上述常见的松墨天牛成虫标本4种保存方式中，以液氮中冷冻保存效果最佳，其次为无水乙醇 -20 ℃冷冻保存，插针干标本室温保藏效果最差。利用昆虫线粒体基因COⅠ和COⅡ的通用引物从上述DNA中均能够成功扩增出目的片段，测序结果证实扩增片段符合预期。研究结果表明液氮和无水乙醇-20 ℃冷冻保存适合松墨天牛成虫标本长期保存，且不影响后续的PCR扩增和测序。

1.2 松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定

实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）是分子生物学领域研究基因表达的最有效方法之一[6]。在RT-qPCR实验过程中，需要引入内参基因对数据进行校正和标准化处理。冯波等[7]从松墨天牛转录组中鉴定出9个候选内参基因（Actin，TUB，18S rRNA，RPS27A，RPS3，RPL10，AK，GAPDH和EFlA），其中后7个候选内参基因在松墨天牛中被首次鉴定。结果显示最适合校正松墨天牛化学感受组织中基因表达数据的内参基因为GAPDH和TUB，并且这样的内参基因组合可以用于不同发育阶段和不同性别的不同化学感受组织。该研究结果为利用RT-qPCR技术分析松墨天牛化学感受组织基因相对表达量的内参基因选择提供了参考。但不同组织在不同条件下内参基因的选择还要视具体研究情况而定，需要进行实验验证。

2 分子分类方法及鉴定

2.1 核糖体28S rDNA基因和18S rDNA基因

张健等[8]对天牛科4亚科32种天牛的28S rDNA基因部分序列进行测定和分析，结果证明了天牛科各亚科的单系性以及异天牛亚科应为较原始类群，并认为28S rDNA序列是一种有效的解析天牛科高级分类阶元系统发育关系的分子标记。魏子涵等[9]采用18S rDNA（V4、V7区）分子标记，分析和测定了49种天牛基因序列，并对天牛总科3科6亚科的70种天牛基因序列构建进化树，结果显示沟胫天牛亚科（Lamiinae）、天牛亚科（Cerambycinae）、锯天牛亚科（Prioninae）和瘦天牛科（Disteniidae）为单系性进化群，这与传统形态学分类结果相似，证明18S rDNA（V4、V7区）是探讨天牛高级阶元分类有效的分子标记。在这两项研究的基础上魏子涵等[10]利用28S rDNA D2和D3区以及18S rDNA V4和V7区联合序列成功构建出了天牛总科高阶元的系统发育树，表明联合序列分析是探讨天牛高阶元分类的有效方法。

2.2 线粒体COⅠ基因和线粒体COⅡ基因

郑斯竹等[11]测定分析了11种墨天牛线粒体DNA细胞色素氧化酶C亚基Ⅰ基因（COⅠ），构建了墨天牛属的分子进化树，结果显示分子结果与形态分类结果相似，本段COⅠ基因可以为墨天牛属分类阶元关系提供依据。李京等[12]研究测得了沟胫天牛亚科部分种类的COⅡ序列，发现族、属、种各阶元间序列差异适中，具有广泛的适用性，并认为COⅡ基因是沟胫天牛亚科分子系统学研究的有效工具。

2.3 DNA条形码在墨天牛鉴定中的应用

为了对进境口岸截获的俄罗斯木材中的墨天牛属（非中国种）害虫进行準确、快速的鉴定，陈梦义等[13]利用DNA条码试剂盒检测技术，基于墨天牛线粒体COⅠ（线粒体细胞色素氧化酶亚基I）基因设计1对巢式引物，对截获墨天牛属中的8个种COⅠ进行扩增，将扩增序列上传至有害生物信息网站，依据碱基位点在不同种间的排列和组成的差异，获得不同种在相应位点上的特有碱基，即标记性碱基，以此作为区分墨天牛种的依据。通过这种墨天牛属DNA条码试剂盒检测技术，可为口岸检疫鉴定提供有效的技术手段。

3 转录组与cDNA文库

3.1 松墨天牛转录组

Lin等[14]通过Illumina测序和从头组装共获得48 787条Unigenes序列，平均长度为721 bp。NR注释的结果表明，78.1%的序列与赤拟谷盗的序列相似性最高。Unigenes的GO分类显示，共有13 485个转录本归属于至少一个GO条目，包括60个功能组，其中在生物过程中，“细胞过程”、“代谢过程”和“单生物过程”包含的基因较多；细胞学成分中，大多数基因集中在“细胞”、“细胞组分”或“细胞器”；在分子功能中，“催化活性”和“binding”中的基因最多。代谢通路分析结果显示在KEGG中可显著比对上18 915个Unigenes，归属于258个通路，代谢通路中的基因数量明显多于其他通路。在NR比对上的序列中有9 005条归属于COG中，25个COG类别中，与基础生理和代谢功能相关的基因最多。在此基础上，鉴定出与杀虫剂解毒和杀虫剂靶标酶相关的基因转录本。上述研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。

3.2 松墨天牛触角cDNA文库

高雄[15]挑取2 052个单克隆进行测序，得到1 133条Unigenes，其中多拷贝contigs有276个，单拷贝singlets有857个。通过预测开放阅读框，计算得到松褐天牛触角cDNA文库GC含量为41.8%。通过与COG功能比对350条Unigenes被分到了21个功能类群。

王娟[16]构建了松褐天牛触角转录组，共获得85 869条contigs序列，平均长度为297 bp；获得37 242条Unigenes序列，平均长度为669 bp。NR注释的结果表明，94.3%的Unigenes与赤拟谷盗[Tribolium castaneum（Herbst）]和中欧山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae Hopkins）的Unigenes相似性最高。对Unigenes按照COG功能注释，可分为25个功能群，其中一般功能预测类，复制、重组和修复类包含的Unigenes个数最多。进一步筛选比对共获得OBPs基因全长序列25条，片段序列4条；化学感受蛋白（CSPs）全长序列8条，片段序列4条；气味受体（ORs）全长序列1条，片段序列8条；1条感觉神经元膜蛋白（SNMPs）全长序列。上述研究结果为开展松褐天牛气味结合蛋白和嗅觉识别机制的研究奠定了基础。

4 基因克隆

4.1 气味结合蛋白基因

利用引诱剂可以有效地防治松褐天牛。为进一步加强引诱剂和天敌的应用研究，研究人员开展了关于松褐天牛气味结合蛋白的初步研究工作，以期通过对松褐天牛嗅觉识别机制的研究，为有效开发更加适合的引诱剂提供研究基础。

钱凯等[17]通过配体结合位点推测Minus-C OBP蛋白亚家族的MaltOBP2和MaltOBP6两个基因具有不同的生理功能；通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别，或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能。该研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础，为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件。

Gao等[18]克隆得到了松墨天牛4个OBPs基因MaltOBP2、MaltOBP3、MaltOBP4和MaltOBP5的全长，成功构建松褐天牛OBPs基因原核表达载体pGEX-6p-1-MaltOBPx，并通过竞争结合实验以1-NPN为探针研究MaltOBP3和MaltOBP5与17种挥发物的结合能力。结果表明，MaltOBP3和MaltOBP5能特异性地结合部分寄主挥发物，它们可能与松墨天牛的寄主选择和定位有关。但尚未涉及对其功能的研究[18]。

王娟[16]成功克隆了松褐天牛Malt OBP9、Malt OBP10、Malt OBP19、Malt OBP21、Malt OBP24基因，其中Malt OBP9和Malt OBP21属于Minus-C OBPs，Malt OBP10属于Classic OBPs，Malt OBP19和Malt OBP24属于Plus-C OBPs。利用荧光竞争结合实验测定这5个Malt OBPs在中性和酸性pH环境下与18种寄主植物挥发物单体的结合特性。结果显示5个Malt OBPs在中性pH环境下与挥发物的结合能力高于酸性pH环境。在中性条件下，Minus-C OBPs家族的2个Malt OBPs结合特性方面表现较为一致；Plus-C OBPs家族的2个Malt OBPs结合特性方面表现出较大差异。

以上研究均在松墨天牛触角cDNA文库和转录组的构建基础上开展，为明确松褐天牛气味结合蛋白的功能，研制行为调节剂，以及明确气味结合蛋白在昆虫体内的功能奠定了重要基础。

4.2 肌钙蛋白基因与原肌球蛋白基因

肌钙蛋白（Troponin，Tn）是与骨骼肌和心肌收缩有关的调节蛋白，主要调节肌肉的收缩和舒张。由于昆虫飞行肌以很高的收缩频率运行，肌钙蛋白的激发和松弛的调节就发挥尤其重要的作用[19]。原肌球蛋白（tropomyosin，Tm）是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白，在肌肉收缩中起重要调节作用。

吴华俊等[20]研究推测松墨天牛肌纤维中存在多种TnT转录本，它们与其他调控因子共同影响肌肉的收缩。但MaTnT有多少转录本，MaTnT转录的时空表达模式如何，以及MaTnT如何与原肌球蛋白互作等仍需要进一步研究。吴华俊等[21]还从已经构建的松墨天牛cDNA文库中筛选并鉴定了一个肌球蛋白轻链2基因，命名为MaMLC-2。软件预测发现MaMLC-2属于肌钙蛋白C超家族成员。该研究发现MLC-2蛋白具有保守地结合Ca2+的功能，其在成虫足中的表达量最高，这与足是主要的运动器官，含有丰富的肌肉蛋白有关。罗淋淋等[22]研究推测松墨天牛在取食松科植物的时候，原肌球蛋白能够促使松树产生诱导性防御。

4.3 其他基因

许雯等[23]分析了松墨天牛表皮蛋白（MoalICP）基因在幼虫各组织中的表达量，发现MoalICP在这些组织中均有表达，说明其表达产物可能参与相应器官的结构形成、蜕皮与变态，也可能与阻止外来物质（如农药）的侵入有关。研究还发现体壁中表皮蛋白基因表达量不是最高的，在脂肪体中的表达量更高，推测脂肪中的表皮蛋白基因参与表皮渗透能力更加显著，与抗药性的产生关系密切。罗淋淋等[24]在松墨天牛铁蛋白亚基中发现了1个糖基化位点。昆虫铁蛋白亚基在细胞内质网和血淋巴中，通常糖基化，这可能增强其稳定性，并且有助于在胞内靶向目标和受体结合[25]。蔡紫玲等[26]研究发现松墨天牛葡萄糖-6-磷酸异构酶（MaGP1）为亲水蛋白，含有活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肤结合位点5个功能位点，为进一步研究MaGPI的分子功能提供了依据。

5 农药胁迫對松墨天牛基因表达的影响

5.1 肌肉LIM蛋白基因

昆虫LIM蛋白具有许多类似于脊椎动物肌肉蛋白的特征，有调控昆虫飞行的作用。罗淋淋等[27]通过PT-qPCR方法研究在农药胁迫下松墨天牛LIM基因（MaLIM）的相对表达量，发现噻虫啉的抑制作用最大。研究推测，在农药亚致死剂量作用下，松墨天牛蛹期蜕皮过程和生长发育功能会受到显著影响。

5.2 延伸因子2（EF-2）基因

延伸因子（elongation factor，EF）是参与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子，在所有多细胞生物体的新陈代谢过程中发挥着非常重要的作用，它包括延伸因子EF-1和延伸因子EF-2[28]。EF-2的正常表达关系到机体细胞的生长及蛋白质的合成。罗淋淋等[29]检测了经农药胁迫后，EF-2 mRNA在松墨天牛成虫中的表达情况，结果显示该基因在啶虫脒作用后的相对表达量最高，其次是杀虫双，绿僵菌和白僵菌的胁迫作用无显著差异，毒死蜱和灭多威的作用效果较弱。不同杀虫剂作用下均导致该基因上调表达，这可能是松墨天牛产生的自我保护反应。

5.3 包囊蛋白基因

包囊是无脊椎动物对抗外源物质的主要防御反应，包囊蛋白（encapsulation-relating protein，ERP）是昆虫产生包囊反应时最先在外来物周围积聚的蛋白[30]。毛珊珊等[31]检测发现松墨天牛ERP（MaERP）经澳氰菊酷、磷化铝、Bt、印楠素、绿僵菌胁迫后，上调表达；经阿维菌素胁迫后，下调表达。该研究为进一步研究MaERP基因在松墨天牛防御过程中的作用奠定了基础，可为探索松墨天牛免疫系统与分子毒理互作关系提供参考。

5.4 核糖体蛋白（RPS15A）基因

核糖体（Ribosome）是细胞内负责蛋白质合成的重要细胞器。核糖体蛋白（Ribosomal protein，RP）和核糖体研究一直是遗传学研究的重要领域。罗淋淋等[32]利用RT-qPCR分析了松墨天牛成虫核糖体蛋白（RPS15A）基因在农药胁迫下的表达量，结果表明，仅溴氰菊酯处理组上调表达。但核糖体蛋白表达量与杀虫剂抗性的关系究竟如何，是通过核糖体蛋白与杀虫剂结合起作用，还是通过核糖体蛋白质间的作用而发挥抗性作用，抑或为其他作用机制还需进一步探究。

5.5 氯胺磷、吡虫啉、溴氰菊酯胁迫下对基因表达的影响

氯胺磷低毒、高效、安全，是中国具有自主知识产权的有机磷杀虫剂创新品种；吡虫啉是新烟碱类杀虫剂，已成为中国取代剧毒有机磷杀虫剂的骨干品种；溴氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂，能杀灭对有机磷农药等产生抗药性的害虫。Lin等[33-35]比较研究松墨天牛对这3种农药分子响应的差异，筛选出差异基因和分子靶标。研究结果表明，细胞色素氧化酶亚基I基因在解毒代谢中有特殊作用，表皮蛋白基因没有参与对这3种农药的抗性；ATP合酶亚基D基因、线粒体酰基载体蛋白1基因等氧化磷酸化通路基因下调，说明氧化磷酸化引发了毒理学变化，这些蛋白质磷酸化的影响可能是有机磷农药、吡虫啉、溴氰菊酯的毒性机制之一，改变昆虫磷酸化水平的蛋白质可能是这些杀虫剂的非传统靶标；吡虫啉、氯胺磷胁迫下，编码丝氨酸蛋白酶、细胞色素P450还原酶、保幼激素酯酶、过氧化物酶和硫氧还蛋白半胱氨酸蛋白酶的基因转录水平下降，表明这两种农药可延缓抗药性并阻碍松墨天牛的发育；GO富集比较分析表明，在3种农药胁迫下，分子功能中“催化活性”富集的基因最多，细胞成分中“细胞”和“细胞组分”富集的基因最多，而生物学过程中，3种农药富集的GO不一致，这表明3种农药在对松墨天牛的毒性机理上有较大差别。

上述研究使用基因芯片作为研究平台，具有集约化、系统化和高通量分析的优点，为鉴定新农药、确定农药的生物选择性奠定理论基础；对以不同类型农药的准确的分子靶标为基础和依据，科学、经济、合理地选用和交替使用不同杀虫机理的农药，有针对性地防治害虫，避免或延缓害虫的抗药性，提高防治效果等具有重要意义。

6 展望

近3年来，松墨天牛分子生物学领域的研究从个别基因的克隆发展到转录组水平，为高通量研究基因奠定了基础；从单纯的生物信息学分析发展到结合生理学、毒理学及化学生态学等综合研究，充分展示了分子生物学的研究优势。基因芯片作为一种研究平台，可用于分子毒理学研究，有助于新型杀虫剂的开发和推广应用。此外，借助于分子分类方法，可对传统形态分类学进行有益的佐证和完善；松墨天牛保存方法和RT-qPCR内参基因的筛选等基础研究对松墨天牛分子生物学起到一定的推动作用。

分子生物学既是一种研究手段，也是一个重要的研究方向。松墨天牛分子生物学的研究日益深入，必然会对松墨天牛生物学、生理生化、化学生态等起到重要的引领作用，并以此为基础，为松墨天牛的综合治理提供理论支撑和应用参考。

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