拉链型脂肽的温控开关效应

王斯佳 李梦雅 徐首红 刘洪来

拉链型脂肽的温控开关效应

王斯佳§李梦雅§徐首红*刘洪来

(华东理工大学化学与分子工程学院，结构可控先进功能材料及其制备教育部重点实验室，上海200237)

亮氨酸拉链型脂肽是由两条肽链以螺旋结构依靠疏水作用并列结合形成的二聚体，当温度升至其相变温度时，其螺旋结构解旋继而变为无序链状结构。利用该类脂肽的温敏性能，本文设计、合成得到一组具有温敏性的拉链型脂肽，将其与磷脂混合制备温敏性脂质体。用圆二色谱测定磷脂双分子层上脂肽的二级结构，动态光散射测定脂肽-脂质体的粒径及电位；荧光偏振法测定脂质体膜的流动性；采用紫外分光光度计考察阿霉素(DOX)在37.0、45.0°C下的释放行为。结果表明，含有脂肽的脂质体具备较好的温敏性，胆固醇含量、脂质体膜的流动性，对脂肽的温控开关效应有一定的影响。脂肽-脂质体作为一种新型的温敏性药物载体展现了其较好的应用前景。

亮氨酸；拉链型脂肽；脂质体；温敏性；药物载体

1 引言

脂质体由于其具备良好的生物相容性和被动靶向性，从而被广泛用作于药物载体1－3。然而，传统的脂质体可以通过各种途径进入血液循环，这大大降低了药物的功效，并且增加了其对健康组织及器官的危害性。因此，为了克服传统脂质体的这些缺点，近年来，研究者对传统脂质体进行修饰，得到了一些新型的脂质体，如光敏感脂质体4,5，pH敏感脂质体6,7及温度敏感脂质体8,9等。

肿瘤的治疗是医药界关注的重点之一10－13。传统化疗法不能实现高效的局部治疗，对健康的细胞或组织也会造成不同程度的损害。然而温度敏感脂质体可以在局部受热部位实现快速释药，从而具备了热靶向性，进而提高药物的利用率。于是，本文旨在设计研究新型的温度敏感脂质体，将其与肿瘤热疗相结合，实现更强的靶向性及控释特性，以提高肿瘤治疗效果。

亮氨酸拉链肽14是由特定的氨基酸序列组成，亮氨酸在每7个氨基酸中出现一次。在一定的温度条件下其可以形成一个超螺旋盘绕线圈，并通过疏水作用力结合而成二聚体的立体结构。当升高温度至其熔融温度时，盘旋的线圈发生解离，形成无序的肽单体15,16。亮氨酸拉链肽响应热的构型变化的性质使其成为修饰温度敏感脂质体的一个备受关注的组分17。

本文设计、合成得到三种具备螺旋结构的双亲性脂肽：C6-28AA(Lp1)，C10-28AA(Lp2)和C8-30AA(Lp3)，并将其与磷脂混合制备得到新型的温度敏感脂质体(Lp-Lipo)(示意图1)。研究它们在45.0及37.0°C条件下，包裹抗癌药物阿霉素的药物释放行为；同时，研究脂质体不同胆固醇含量对脂肽温敏性及释药情况的影响，进而得到一种具有最佳抗癌效果的新型温度敏感的药物载体。

2 实验部分

2.1 实验试剂

自行设计的亮氨酸拉链型脂肽(Lp1:CH3-(CH2)4-CO-NH-VAQLEVK-VAQLESKVSKLESKVSSLESK-COOH,Lp2:CH3-(CH2)8-CO-NH-VAQLE VK-VAQLESKVSKLESK-VSSLESK-COOH,Lp3: CH3-(CH2)6-CO-NH-AS-VAQLEVK-VAQLESKVSK ESK-VSSLESK-COOH,＞95%，杰肽生物有限公司)；二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC，＞98%，Lipoid公司)，二棕榈酰磷酯酰乙醇胺(DPPE，＞98%，Lipoid公司)；二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC，＞98%，Sigma-Aldrich公司)；阳离子胆固醇(Chol，＞98%，Avanti公司)；三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，＞98%，Aladdin公司)；葡聚糖(G-50，＞95%)，阿霉素(DOX，＞98%)和1,6-二苯基-

示意图1 脂肽的结构及脂肽-脂质体的温控释药性能Scheme 1 Structure of Lp and thermo-controlled drug release of Lp-Lipo 1,3,5-己三烯(DPH，＞98%)购于百灵威科技有限公司；甲醇、氯仿等分析级别的溶剂购于国药集团化学试剂有限公司。

2.2 脂质体的制备

单纯脂质体与磷脂/脂肽的混合脂质体均利用薄膜分散法制备。首先，将一定比例的DSPC、DPPE、DOPC和Chol溶于氯仿/甲醇(体积比为2:1)的混合溶液，并加入至250 mL的圆底烧瓶中；若制备的是混合脂质体，需在该混合溶液中加入脂肽。然后利用旋转蒸发仪(N-1001，上海爱朗仪器有限公司)将溶剂除去，得到脂质薄膜。加入5 mL的Tris-HCl缓冲溶液(10 mmol·L－1，pH=7.4)，48.0°C条件下利用超声仪(KQ-100TDB，昆山市超声仪器有限公司)超声30 min得到浓度6 mmol·L－1的脂质体样品。最终，利用含有200 nm聚碳酸酯滤膜的挤压器(LiposoFast-Basic，Avestin，加拿大)对样品进行11次过滤，最终得到粒径小于200 nm且分布均匀的样品。

2.3 动态光散射(DLS)

脂质体样品的粒径、多分散指数及表面电荷均利用动态光散射(Zetasizer Nano-ZS，马尔文，英国)测量得到，其中多分散指数反映了粒径分布的集中程度。

2.4 透射电子显微镜(TEM)

将20 μL磷钨酸附染后的脂质体样品加入至铜网上，待样品烘干后，采用透射电子显微镜(JEM-1400，JEOL，日本)对样品进行观察测量。

2.5 圆二色谱(CD)

圆二色谱是利用分光光度计(Chirascan，Applied Photophysics Ltd，英国)来测量多肽类物质的二级结构18,19，其中含有一个热电温度控制系统。利用圆二色谱对含有脂肽的混合脂质体(脂肽浓度固定为50 μmol·L－1)样品进行了一系列不同温度下的构象测量。将含有脂肽的样品加入至规格为2 mm的石英比色皿，扫描范围设定为260至190 nm，以1°C·min－1的速率从20.0°C升温至70.0°C，每增加2.0°C记录一次数据，得到最终的响应温度变化的圆二色谱图。嵌入在脂质体上的脂肽的相变温度Tm通过光物理学软件Glob3分析计算得到。

2.6 荧光各向异性

选择疏水性分子1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)作为荧光探针以检测磷脂双分子层的流动性20,21。配置溶液浓度为2×10－7mol·L－1的DPH溶液，将其以n(lipids):n(DPH)=800:1的质量比与脂质体混合得到混合溶液，并将其放置于常温下搅拌12 h。DPH荧光探针在脂质体上的各向异性通过荧光光度计(LS-55，PerkinElmer，美国)来测量。选择激发波长360 nm、发射波长430 nm，且狭缝宽度均为10 nm进行测量，其中温度是通过一个连接的恒温水浴来控制，测量从20.0°C进行到70.0°C，每隔5.0°C记录一次测量数据。最终的各向异性值是通过以下方程计算得到22,23：

其中，r代表各向异性。荧光发射强度定义为i，其下标vv和vh分别代表激发偏振片与发射偏振片各自的方向。其中，G是一个矫正仪器偏振度的因子，定义为ihv/ihh。

2.7 阿霉素的装载及释放

包裹抗癌药物阿霉素的脂质体是通过硫酸铵梯度法制备得到。制备方法与2.2节类似，其中缓冲溶液变为硫酸铵溶液(200 mmol·L－1)；经水化得到脂质体样品后，利用生理盐水溶液对其进行透析10次后，将其与一定量的阿霉素溶液(2.5 mg· mL－1)混合至50°C下孵化45 min，然后利用凝胶过滤的方法将未被包裹的阿霉素除去，得到装载阿霉素的脂质体。其中，分别取200 μL的未过滤和已过滤后的样品与等量的曲拉通溶液加入至5 mL容量瓶定容后得到混合溶液，高温下超声30 min后，利用紫外分光光度计(UV)(UV-2450，岛津，日本)测量两者溶液在485 nm处的紫外吸收值，分别为A0、A1。阿霉素的包封率即为A1/A0，本研究的包封率均在80%(w)以上。

阿霉素的释放实验是在37.0与45.0°C下进行的。取定量的样品放置于截留量为3500的透析袋中，外围放置25倍体积的Tris-HCl缓冲溶液且控温。每隔1 h，取3 mL的透析液，利用UV测量其在485 nm处的吸收值，记为At，24 h后停止测量，且每次测量结束后将透析液倒置于原处。阿霉素的累积释放率为At/A1。

3 结果与讨论

3.1 脂肽-脂质体的物性

以n(DSPC):n(DPPE):n(Chol)=2:0.1:1的比例混合制备得到空白脂质体Lipo，以n(lipid): n(lipopeptide)=100:1的比例分别加入三种脂肽Lp1、Lp2及Lp3制备得到脂肽-脂质体Lp-Lipo。利用动态光散射测量四种脂质体的粒径、分散系数及其表面电荷，如表1所示。结果显示，脂质体的粒径均在200 nm左右，说明脂肽的加入并不会影响脂质体的粒径分布，且较小的多分散指数(PDI)值证明其粒径分布较为均一。同时，由于阳离子胆固醇的存在，使脂质体表面均带有50 mV左右的正电荷。为了更加直观地观察脂质体的真实形貌及大小，利用透射电镜对其进行表征，结果如图1(b)所示。从图中可以看出，脂质体是以球状结构存在的，且粒径大小约200 nm，结果与DLS结果一致(图1(a))。

3.2 脂肽-脂质体的温敏性

利用圆二色谱，测定嵌在磷脂双分子层上的脂肽随温度变化的构象变化。如图2所示，三种脂肽在20.0°C下的圆二谱图，均具备192 nm的正峰及208、222 nm处的负峰，这是典型的α-螺旋结构，说明常温下，在脂质体双层膜中的三种脂肽均以双螺旋结构存在。随着温度的升高，脂肽的二级结构发生变化；对于Lp1-Lipo与Lp3-Lipo，当温度升高至70.0°C时，其螺旋含量大大降低，向无规卷曲状转变，其相变温度Tm由分析软件

表1 脂质体的粒径、分布系数及其表面电位Table 1 Diameters,polydispersity index and

zeta-potentials of liposomes

Liposome Lipo

Lp1-Lipo Lp2-Lipo Lp3-Lipo d/nm 192.5 188.7 186.6 193.8 Zeta/mV

图1 脂质体的粒径分布(a)及TEM图(b)Fig.1 Size distribution(a)and transmission electron mictroscopy(TEM)images(b)of liposomes

55.1 56.0 46.5 48.7 PDI:polydispersity PDI 0.121 0.142 0.156 0.129 Global 3计算得到，分别为45.5、45.0°C；对于Lp2-Lipo，从图2(b)可以看出，即使在高温条件下，Lp2依然保持螺旋状态，此时计算得到的温度45.4°C并不代表其真正的相变温度。对比Lp1-Lipo与Lp2-Lipo发现，烷烃链的增长，大大增加了脂肽螺旋结构的稳定性，从而影响了其相变行为；对于Lp2-Lipo与Lp3-Lipo，将两个烷烃变为两个氨基酸(丙氨酸与丝氨酸)，降低了脂肽的稳定性，使得Lp3-Lipo在高温下发生了更为彻底的相变。所以，烷烃链的长短以及氨基酸的端基修饰均会影响脂肽的二级结构的变化，烷烃链越长，脂肽的螺旋结构越稳定24,25；同时，在N端修饰丙氨酸与丝氨酸，会大大降低脂肽的二级结构的稳定性，从而使其具有更好的温敏性能。

3.3 脂肽-脂质体膜的流动性

为了更好地理解磷脂分子与脂肽之间的相互作用，选择DPH作为荧光探针，测定脂肽-脂质体随温度变化的脂质体膜的流动性。由于DPH为疏水性分子，所以测量得到的结果显示了磷脂双分子层疏水部分的扰动。结果如图3所示，无论是空白脂质体还是脂肽-脂质体，其各向异性值均随着温度的升高而降低，且在52.0°C附近出现了最为显著的变化，这是因为在此温度范围，磷脂分子发生了凝胶态向液晶态的转变26。对比图3中的四条曲线，发现，在低于脂质体的相变温度时，脂肽的加入对脂质体膜的流动性影响不大；而随着温度的升高，脂肽的作用就突显出来：Lp1与Lp3的加入增加了膜的流动性，而Lp2的加入大大提高了膜的稳定性。正如3.2节中所述，由于Lp1与Lp3在升温过程中二级结构发生了较大的变化，从而导致其对磷脂分子的扰动，进而增加了膜的流动性；相反，由于Lp2疏水端较长的烷烃链，导致其二级结构较为稳定，即使在高温条件下结构也基本不发生改变，从而抑制了周围磷脂分子的流动，增加了脂质体膜的稳定性。

图2 Lp1-Lipo(a),Lp2-Lipo(b)及Lp3-Lipo(c)随温度变化的构象变化Fig.2 Temperature-dependent conformational changes of Lp1-Lipo(a),Lp2-Lipo(b)and Lp3-Lipo(c)

图3 DPH在空白脂质体及脂肽-脂质体中随温度变化的各向异性值Fig.3 Fluorescence anisotropy of DPH in Lipo and Lp-Lipo measured as a function of temperature

3.4 脂肽-脂质体的体外模拟释药

利用硫酸铵梯度法将抗癌药物阿霉素包裹在脂质体内，包封率可达80%(w)。通过测量四种脂质体在37.0与45.0°C下阿霉素的累积释放量，研究脂质体膜上脂肽的温敏性能。如图4所示，37.0°C时，无论是空白脂质体还是脂肽-脂质体，释放量均较小，保持在10%(w)左右，这是因为此温度下的脂肽分子保持螺旋结构，磷脂分子也处在凝胶态，且大量胆固醇的存在，均会使得脂质体的结构相对稳定，从而造成较少量的药物的泄漏。但是对比发现，Lp3-Lipo的药物泄漏量略大于空白脂质体，而Lp2-Lipo的药物泄漏量略小于空白脂质体，此结果与3.3节中膜的流动性相一致。37.0°C下Lp3的加入降低了膜的稳定性，相反Lp2却提高了膜的稳定性，这证明了在低温时，药物阿霉素的泄漏只与脂质体膜的流动性有关。而45.0°C时，脂肽-脂质体的累计释放量均远远大于空白脂质体，这说明在温热条件下，脂肽二级结构的变化，螺旋结构的解离，在脂质体膜上形成孔道，从而大大提高药物的释放，证明了脂肽具有温敏性。对比三种脂肽-脂质体的释药情况发现，正如图2的圆二色谱结果所示，由于Lp2的疏水尾链烷烃链最长，疏水作用力过大，使得其两条肽链很难发生相变而分离，从而导致其温敏性较差，最终导致其作用在脂质体上的药物释放最少；而其中Lp3的温敏性最好，Lp1次之，最终导致温热条件下Lp3-Lipo的药物释放量最大且最快。以上结果证明了在45.0°C条件下，脂肽-脂质体的药物释放主要依赖于双层膜中嵌入的脂肽的温敏性。综上，脂肽-脂质体具备良好的温敏性释药效果，其中Lp3-Lipo效果最佳，展现了其作为一种新型的温敏性药物载体的良好的应用潜能。

3.5 胆固醇对脂肽-脂质体释药性能的影响

胆固醇在生物膜中起着至关重要的作用，其具有双亲性，不仅可以提高脂质体的稳定性，而且与磷脂具备良好的相容性，从而起到调节脂质体膜流动性与通透性的作用，被称为脂质体膜的“缓冲剂”27,28。为了研究胆固醇含量对脂质体膜性能和脂肽温敏性能的影响，研究了摩尔比n(lipid): n(Chol)为8:1，4:1及2:1条件下的Lp-Lipo的体外释药情况。

图4 空白脂质体及脂肽-脂质体在37.0及45.0°C条件下的释药动力学Fig.4 Drug release dynamic of Lipo and Lp-Lipo at 37.0 and 45.0°Csolid:45.0°C,hollow:37.0°C

图5 45.0°C条件下DPH在含有不同胆固醇含量的脂肽-脂质体中的各向异性值Fig.5 Fluorescence anisotropy of DPH in Lp-Lipo with different amounts of Chol at 45.0°C

图6 胆固醇含量(n(Lipids):n(Chol)=8:1/4:1/2:1)对三种脂肽-脂质体的释药动力学的影响Fig.6 Drug release dynamic of Lp-Lipo containing different amounts of Chol(n(Lipids):n(Chol)=8:1/4:1/2:1) solid:45.0°C,hollow:37.0°C

表2 脂肽-脂质体在37.0和45.0°C条件下24 h的药物累积释放量Table 2 Total release percentage of DOX from various Lp-Lipo at 37 and 45.0°C over 24 h

图5显示了在45.0°C条件下不同胆固醇含量的脂质体加入三种脂肽后的各向异性值。首先，从图中可以看出，当n(lipid):n(Chol)为8:1和4:1时，其膜的流动性基本不变，而当胆固醇含量增加至n(lipid):n(Chol)=2:1时，各向异性值有较大程度的增加，说明在该实验条件下，胆固醇含量增加至一定量时，才会对脂质体膜起到稳定的作用。然后对比每种胆固醇含量下的三种脂肽-脂质体的各向异性，发现，Lp2相较于Lp1与Lp3，具有稳定膜的功能，原因如3.2节中所述，Lp2在脂质体中发生相变后引起的自身空间结构变化最小，温敏性最差，所以造成的扰动最小，抑制了磷脂分子的运动。总体而言，不同的脂肽分子，在不同含量的胆固醇的影响下，温热条件下会发生不同程度的构象变化，从而对磷脂分子的热运动造成不同的影响。

为了更加直观地分析胆固醇含量对于脂肽-脂质体的温敏性释药的影响，分别测定了三种胆固醇含量的三种脂肽-脂质体的释药动力学，结果如图6所示。表2列出了其在37.0与45.0°C下24 h后的药物累积释放量。首先，无论是何种组分的脂质体，45.0°C下的释药量均大于37.0°C的，这证明了三种脂肽均具有较好的温敏性能，且温敏性能较为稳定。然后对比不同胆固醇含量的脂质体之后，发现，n(Lipids):n(Chol)为4:1时的药物释放量均最大，与何种脂肽无关。对于n(Lipids): n(Chol)为2:1而言，正如图5所示，胆固醇的增加，大大提高了脂质体膜的稳定性，一方面，会使得脂质体结构更加致密，减少药物的释放；另一方面，过于稳定的膜，会阻碍脂肽在温热条件下的双螺旋结构解旋和分离，从而导致药物释放减少。而对于n(Lipids):n(Chol)为8:1而言，胆固醇分子较少，在温热条件下，磷脂分子的热运动不会受到过多的限制，所以当脂肽螺旋结构解旋，双链分离开形成孔道时，可能会因为周围磷脂分子的易流动性而弥补孔道，从而导致药物的释放相对较低。显然，n(Lipids):n(Chol)为4:1时，胆固醇作为脂质体的流动缓冲剂，既可以限制磷脂分子的剧烈运动，又不会阻碍脂肽分子的二级结构的变化。所以，当n(Lipids):n(Chol)为4:1时，有利于脂肽实现其最佳的温敏性能。综合以上结果分析得到，无论是脂肽分子的温敏性(分子结构影响)，还是脂质体膜的流动性(胆固醇含量影响)，都会影响脂肽-脂质体的药物释放；当n(Lipids):n(Chol)为4:1，且选择Lp3脂肽，得到的脂肽-脂质体具有最佳的温敏性，可以实现最大最快的药物释放。

4 结论

设计了一系列的具有亮氨酸拉链结构的双亲性脂肽Lp1，Lp2及Lp3，在温热条件下，脂肽可以由双螺旋结构解旋为无规则卷曲状的单链，从而使其具备良好的温敏性能。将这一系列脂肽与磷脂混合制备得到的脂肽-脂质体，一定的温热条件下，利用脂肽的温敏性在脂质体膜上形成孔道，从而实现所载药物的释放。研究结果表明，Lp3具备最佳的温敏性能，同时n(Lipids):n(Chol)比为4:1时，更有利于脂肽分子温敏性的实现，得到的脂肽-脂质体可以实现最大最快的药物释放，这说明脂肽分子的结构以及脂质体膜的性质均会影响脂肽的温控开关效应，进而影响脂肽-脂质体的温敏性释药行为。脂肽-脂质体作为一种新型的药物载体，具有较好的发展应用前景。且该研究也为设计新型的温敏性药物载体提供了良好的理论基础。

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Thermo-Controlled On-Off Switch of Zipper-Structured Lipopeptides

WANG Si-Jia§LI Meng-Ya§XU Shou-Hong*LIU Hong-Lai
(Key Laboratory for Advanced Materials and Institute of Fine Chemicals of the Education Ministry of China,College of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,P.R.China)

The leucine zipper lipopeptide is a dimer composed of two lipopeptides with α-helical structures that interact through hydrophobic forces.When heated to its phase transition temperature,the helixes unwind and form a disordered conformation.Based on the thermo-sensitivity of these leucine zipper lipopeptides,we designed and synthesized a series of zipper-structured lipopeptides and then mixed them with lipids to form thermo-sensitive hybrid liposomes.Circular dichroism was used to investigate the secondary structure of the lipopeptides anchored in the liposomal bilayer.Dynamic light scattering measurements were used to assess the diameters and zeta potentials of the liposomes.Fluorescence polarization was measured to study the fluidity of the liposomal bilayer.An ultraviolet spectrophotometer was used to stimulate Doxorubicin(DOX)release in vitro at 37.0 and 45.0°C.We found that Lp-Lipo(hybrid of lipopeptide and liposome)displayed higher thermosensitivity than pure liposome.The cholesterol content and fluidity of the liposomal bilayer affected the thermocontrolled on-off switch of the lipopeptides.Lp-Lipo shows great potential as a novel thermo-sensitive drug carrier.

Leucine;Zipper-structured lipopeptide;Liposome;Thermo-sensitivity;Drug carrier

.Email:xushouhong@ecust.edu.cn;Tel:+86-21-64251942.

§These authors contributed equally.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21276074).国家自然科学基金(21276074)资助项目

O647

10.3866/PKU.WHXB201701062

Received:December 12,2016;Revised:January 6,2017;Published online:January 6,2017.*