黄芪药材不同提取部位增强免疫力的药效学研究

洪 妍， 刘小花， 陈亚丽， 王 波,2，徐红坤， 吴志华， 闵云霞， 封士兰

(1.兰州大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省出入境检验检疫局 综合技术中心，甘肃 兰州 730000)

黄芪药材不同提取部位增强免疫力的药效学研究

洪 妍1， 刘小花1， 陈亚丽1， 王 波1,2，徐红坤1， 吴志华1， 闵云霞1， 封士兰1

(1.兰州大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省出入境检验检疫局 综合技术中心，甘肃 兰州 730000)

比较研究了黄芪药材不同提取部位对小鼠免疫调节作用的药理活性.灌胃给予正常小鼠和免疫抑制小鼠黄芪的不同提取部位，检测了小鼠的吞噬指数、迟发型变态反应(DTH)程度、外周白细胞总数、脏器指数及干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素- 4(IL- 4)的水平.实验结果表明：黄芪水煎煮部位和小分子部位能显著提高正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫功能(P<0.01；P<0.05)；10批黄芪药材小分子部位均能明显提高免疫抑制小鼠的吞噬指数和DTH程度(P<0.01；P<0.05)；某些产地样品能显著提高免疫抑制小鼠的脏器指数及IFN-γ，IL- 4的水平(P<0.01；P<0.05)，表明黄芪药材的产地与免疫调节作用密切相关.

免疫调节；黄芪药材；吞噬指数；迟发型变态反应

黄芪在免疫调节方面有着非常悠久的用药历史.《黄帝内经》中提出“正气存内，邪不可干”，其中的“正气”即为现代医学所说的免疫力[1].《本草纲目》中称黄芪为“补者之长”，“可治一切气衰血虚之症”.现代药理学研究证实[2]，黄芪可显著增强机体免疫力，提高癌症患者的生存质量.

本实验室前期研究获得了黄芪95%乙醇提取物的5个不同的提取部位，并进行了小鼠碳廓清实验[3]，结果显示其中水提取部位具有增强小鼠免疫力的作用.结合中医临床黄芪用药疗效部位，其水煎煮提取生产工艺简单、成本低廉，提示黄芪水煎液提高机体免疫功能的药效成分可能来源于小分子物质.据此，本实验采用水煎煮提取工艺得到了黄芪水煎液，并通过乙醇沉淀得到其上清小分子部位和醇沉部位.本文探讨了所获得的黄芪不同提取部位对正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫调节作用，筛选出黄芪提高免疫力的较优部位；进而，对黄芪药材的较优药效部位进行了多指标(吞噬指数、迟发型变态反应程度、外周白细胞总数、细胞因子及脏器指数)测定分析，综合评价筛选出黄芪药材提高免疫力的最优部位；最后，研究了不同产地黄芪药材最优部位的免疫调节作用，以期说明黄芪产地与药性的关系.

1 仪器与材料

1.1 实验动物

SPF级雄性昆明种小鼠，体质量为18～22 g，由兰州大学动物实验中心提供，合格证号 SCXK(甘)2013- 0002.给药前一周进行适应性饲养，自由进食进水.

1.2 药材与试剂

10批黄芪药材，2015年购买或采自全国产地种植或野生黄芪，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定均为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao，编号及来源见表1.

注射用环磷酰胺(安道生，德国百特公司，批号为5K084A)；印度墨汁(西安罗森伯科技有限公司)；2,4- 二硝基氟苯(DNFB，麦克林股份有限公司)；硫化钠(天津市巴斯夫有限公司)；芝麻油(上海太太乐食品有限公司)；小鼠IFN-γ,IL- 4 ELISA试剂盒(欣博盛生物科技公司，批号均为160729).

表1 黄芪药材的来源

1.3 主要仪器

CR22GII,HITACHI离心机(日本株式会社日立制作社)；Z36HK超高速冷冻离心机(德国贺默仪器科技有限公司)；Freezone 6PWS型真空冷冻干燥仪(美国Labconco公司)；UV- 1700 紫外分光检测仪(日本岛津公司)；BC- 5390 CRP全自动血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗股份有限公司)；550酶联免疫检测仪(美国Bio- Rad 公司).

2 实验方法

2.1 样品制备

称取已粉碎的黄芪药材(产自内蒙古银号) 500 g，按文献[3]方法提取，浓缩得到水提取部位.

称取1 kg黄芪药材，依次用10倍量水煎煮2 h，8倍量水煎煮1.5 h及6倍量水煎煮1 h，合并水煎液，过滤，取其中1/2浓缩至干，即得水煎煮部分；剩余1/2浓缩后加乙醇使其最终体积分数为70%，静置沉淀过夜后离心，上清液浓缩至干得到小分子部分，沉淀真空冷冻干燥得醇沉部分.根据各部分的出膏率换算出小鼠的给药剂量.

2.2 黄芪不同提取部位对正常小鼠免疫功能的作用

将100只小鼠随机分成免疫Ⅰ组和Ⅱ组两大组，Ⅰ组进行碳廓清实验，Ⅱ组进行迟发型变态实验及胸腺、脾脏指数测定.每大组下设5个小组，分别为空白对照组和4个不同部位的给药组，每组10只小鼠.空白对照组给予生理盐水，各给药组按原生药5.0 g·kg-1的剂量换算后给予黄芪提取物.连续给药4周后测定各项指标.

2.3 黄芪不同提取部位对免疫抑制小鼠免疫功能的作用

将240只小鼠随机分成免疫 Ⅰ 组、Ⅱ组和Ⅲ组三大组，Ⅰ组、Ⅱ组测定指标同上，Ⅲ组测定外周血白细胞数.每大组下设8个小组，分别为空白对照组、模型对照组及水煎煮、小分子和醇沉部分的高、低剂量组，每组10只小鼠.空白对照组和模型对照组给予生理盐水，给药组按原生药5.0 g/kg(低剂量)和10.0 g/kg(高剂量)换算后给药.灌胃4周，在第3周后，除空白对照组外其余各组小鼠连续2 d腹腔注射55 mg·kg-1新鲜配制的环磷酰胺.造模后第5天测定各项指标.

2.4 10批黄芪药材小分子组对免疫抑制小鼠免疫功能的作用

将360只小鼠随机分成Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组三大组，Ⅰ组、Ⅱ组测定指标同上，Ⅲ组测定细胞因子IFN-γ和IL- 4的水平.每大组下设12个小组，分别为空白对照组、模型对照组和10批黄芪小分子高剂量组.空白对照组和模型对照组均给予生理盐水，给药组按原生药10.0 g·kg-1的剂量换算后给药.其余操作同上.

2.5 各项指标的测定方法

2.5.1 碳廓清实验

小鼠尾静脉注射用生理盐水1∶3稀释的印度墨汁10 mL·kg-1，于注射后2 min和10 min从眼眶后静脉丛取血40 μL，加入4 mL 0.1%Na2CO3溶液中，充分混匀后在600 nm波长下测定吸光度值，以0.1%Na2CO3溶液为空白.小鼠处死后，称量其肝脏和脾脏的质量，按文献[4]的

方法计算其吞噬指数α.

2.5.2 迟发型变态反应实验

本实验采用耳肿胀法测定小鼠迟发型变态反应程度.小鼠腹部用8%Na2S溶液脱毛后，吸取10 mg·mL-1DNFB丙酮麻油(1∶1)溶液50 μL，均匀涂于其腹部.5 d后，将10 μL DNFB溶液涂抹于小鼠右耳两侧，24 h后处死小鼠，在其左右耳取下直径为0.8 cm的耳片，按文献[4]的方法计算，以左右耳质量差值反映小鼠的DTH程度.

2.5.3 脏器指数测定

取小鼠的胸腺和脾脏，称量胸腺、脾脏的质量及体质量，计算胸腺指数和脾脏指数.

2.5.4 外周白细胞总数测定

小鼠眼眶后静脉丛取血，加入稀释液中，于全血细胞分析仪中检测.

2.5.5 细胞因子测定

收集小鼠血浆，将血浆标本按1∶2加入标本通用稀释液稀释后，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，于450 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算IFN-γ和IL- 4的含量.

2.6 统计学处理

3 实验结果

3.1 黄芪不同提取部位对正常小鼠免疫功能的作用

从表2可知：与空白对照组相比，黄芪小分子组的吞噬指数和脾脏指数均呈显著性差异(P<0.05)；水煎煮组与空白对照组相比，除胸腺指数无显著性差异外，其余各项指标均呈现显著性差异(P<0.05；P<0.01)；水提取部位与空白对照组相比，仅脾脏指数呈现显著性差异(P<0.01)；醇沉组仅胸腺指数呈显著性差异(P<0.05).由此可见，黄芪小分子组和水煎煮组较水提取部位组在改善免疫指标方面有明显的优势.

表2 黄芪不同提取部位对正常小鼠免疫功能的影响

注：与空白对照组相比，##表示P<0.01；#表示P<0.05.

3.2 黄芪不同提取部位对免疫抑制小鼠免疫功能的作用

为了进一步筛选出提高小鼠免疫力的最优药效部位，本实验探讨了黄芪不同提取部位2个剂量组对免疫抑制小鼠免疫功能的作用，结果见表3.与空白对照组相比，模型对照组的5项指标均有极显著性差异(P<0.01)，说明小鼠免疫抑制模型制备成功.与模型对照组相比，小分子低剂量组的吞噬指数、胸腺指数和脾脏指数均有显著性差异(P<0.01；P<0.05)；高剂量组的吞噬指数、DTH程度及胸腺指数均有极显著性差异(P<0.01).与模型对照组相比，黄芪水煎煮低剂量组仅DTH程度具有显著性差异(P<0.05)；高剂量组的吞噬指数、DTH程度及脾脏指数均具有显著性差异(P<0.01；P<0.05).与模型对照组相比，醇沉低剂量组的吞噬指数和外周白细胞总数均有显著性差异(P<0.01；P<0.05)；高剂量组的吞噬指数和脾脏指数有极显著性差异(P<0.01).说明其作用存在一定的剂量效应关系.

因为吞噬指数、DTH程度及外周白细胞总数是评价免疫功能的主要指标，综合正常小鼠及免疫抑制小鼠的药效学数据，可以看出，黄芪水煎煮部位和小分子部位提高小鼠免疫功能的剂量效应关系较为显著.据此，本实验选用高剂量小分子组进行不同产地黄芪药材的免疫药效学实验.

表3 黄芪不同提取部位对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

注：与空白对照组相比，##表示P<0.01.与模型对照组相比，**表示P<0.01；*表示P<0.05.

表4 10批黄芪药材小分子组对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

注：与空白对照组相比，##表示P<0.01；#表示P<0.05.与模型对照组相比，**表示P<0.01；*表示P<0.05.

3.3 10批黄芪药材小分子组对免疫抑制小鼠免疫功能的作用

不同产地黄芪的免疫调节作用实验结果见表4.由表4可知:模型对照组与空白对照组相比均有显著性差异(P<0.01；P<0.05)，说明小鼠免疫抑制模型制备成功；与模型对照组相比，10批黄芪药材的吞噬指数和DTH程度均明显增加(P<0.01；P<0.05)；与模型对照组相比，仅样品1和样品6的胸腺指数有显著性差异(P<0.01；P<0.05)，脾脏指数除样品9和样品10外均有显著性差异(P<0.01；P<0.05)；细胞因子方面，与模型对照组相比，样品1,2,4,5,8和10的IFN-γ含量有显著性差异(P<0.01；P<0.05)，样品1,2,5和10的IL- 4含量有显著性差异(P<0.01；P<0.05).10批不同产地的黄芪药材均能在不同程度上提高免疫抑制小鼠的免疫功能，山西浑源、甘肃莲峰、甘肃双泉及陕西渭南4个产地的黄芪药材提高免疫功能的作用更为突出，说明黄芪药材产地与免疫活性有着密切的关系.

4 讨 论

本实验采用腹腔注射环磷酰胺的方法建立免疫抑制小鼠模型.环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)作为一种细胞毒性化疗药物，主要通过干扰癌细胞核酸代谢促使癌细胞凋亡的发挥作用，是制备免疫抑制模型的一种常用药物[5- 6].有文献报道，连续注射40 mg·kg-1CTX制备免疫抑制模型特异性较差[7].结合《保健食品检验与评价技术规范》[4]的造模方式，本实验室比较了腹腔注射几种不同剂量CTX的造模情况，连续2 d腹腔注射55 mg·kg-1CTX，5 d后测定各项免疫学指标，模型对照组与空白对照组相比有极显著性差异，确定为最终的造模方式.本实验采用正常小鼠和免疫抑制小鼠2种方案，分别对黄芪不同提取部位进行了多指标测定分析，综合评价了黄芪不同提取部位对小鼠的免疫药效作用.

黄芪水煎液中除含有黄芪多糖等免疫活性较强的大分子化合物外[8]，还含有黄酮及皂苷类成分，这些小分子物质也具有很强的免疫调节活性.其中，总黄酮可以提高免疫抑制小鼠的CD4+T淋巴细胞水平，升高CD4+/CD8+比值及血清中IFN-γ的水平[9].总皂苷能增强小鼠腹腔巨噬细胞的免疫作用，可能与其引起Ca2+浓度升高从而激活巨噬细胞发挥免疫作用有关[10].由表2和表3可以看出，黄芪水煎煮组和小分子组均能显著提高小鼠免疫功能，在所测定的几项主要指标中，二者显著性基本一致，说明小分子组基本可以代表黄芪水煎煮组的免疫活性.由于水煎液中醇沉部分提高免疫力效果并不明显，说明醇沉部分在黄芪水煎液中提高免疫力的作用可忽略不计.因此，本实验选择黄芪小分子组进行10批不同产地黄芪药材的免疫药效学研究.

本研究结果显示，10批黄芪药材小分子组可明显提高小鼠的免疫功能.以吞噬指数、DTH程度和细胞因子含量作为主要指标，结合胸腺指数和脾脏指数，可以看出，山西浑源、甘肃莲峰、甘肃双泉及陕西渭南4个黄芪的给药组小鼠与免疫抑制小鼠相比，其免疫学药效指标均有明显提高，说明黄芪药材的产地与免疫药效作用有着密切的关系.后续研究中，可将所得药效学数据与黄芪小分子组指纹图谱进行关联，多方面综合评价黄芪药材质量与免疫药效学之间的关系，揭示道地药材优质性的科学内涵，为进一步开发利用黄芪提供坚实的出发点.

[1]马德莲,郭玲,李欣华,等.中草药的免疫作用[J].中国实验方剂学杂志,2003,9(5):63- 64.

[2]田洪文,于洪梅,冯琦.黄芪注射液并口服参芪片对机体化疗后免疫功能的影响[J].哈尔滨医药,2005,25(6):68- 69.

[3]刘小花,梁瑾,任远,等.黄芪对机体免疫力影响的谱效关系研究[J].中药材,2012,35(12):1978- 1981.

[4]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003年版.[2003- 02- 26].

[5]United States Environmental Protection Agency.Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 immunotoxicity[S].1998- 08- 01.

[6]Hall A G,Tilby M J.Mechanisms of action of,and modes of resistance to,alkylating agents used in the treatment of haematologicalmalignancies[J].Blood Reviews,1992,6(3):163- 173.

[7]宋雁,贾旭东,崔文明,等.不同途径和剂量环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的对比研究[J].中国食品卫生杂志,2013,25(3):218- 225.

[8]史晶晶,时博,苗明三.黄芪多糖对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].中医学报,2016,31(2):243- 246.

[9]颜培宇,于晓红,张德山,等.黄芪总黄酮对免疫功能低下小鼠T细胞极化的影响[J].浙江中医药大学学报,2008,32(2):163- 164.

[10]杨小敏,徐晓武,卢荷莲,等.黄芪皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫增强作用[J].中国免疫学杂志,2008,24(9):804- 807.

(责任编辑 薛 荣)

Pharmacodynamical study about immunoenhancement effect of RadixAstragalion mice

HONG Yan1, LIU Xiaohua1, CHEN Yali1, WANG Bo1,2,XU Hongkun1, WU Zhihua1, MIN Yunxia1, FENG Shilan1

(1.CollegeofPharmacy,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China; 2.GansuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauCentralLaboratoryofTechnicalCenter,Lanzhou730000,China)

Different RadixAstragaliextracts on immunomodulatory effect of pharmacological activities were compared. After oral administration of different RadixAstragaliextracts on normal and immunosuppressed mice, phagocytic index, delayed type hypersensitivity (DTH) degree, leukocyte count, organs index and the level of cytokines IFN-γ, IL- 4 (ELISAs) were investigated four weeks later. By the comprehensive comparison of different extracts, it was found that high dose of water decoction and supernatant extracts both significantly improved immunological function on normal and immunosuppressed mice (P<0.01;P<0.05); 10 batch of RadixAstragalisupernatant extracts significantly improved phagocytic index, DTH degree (P<0.01;P<0.05), and some samples significantly improved organs index and the level of cytokines IFN-γ, IL- 4 (P<0.01;P<0.05) on immunosuppressed mice.The source of RadixAstragalisupernatant extracts was found closely related to the immunomodulatory effect.

immunomodulatory effect; RadixAstragali; phagocytic index; delayed type hypersensitivity

10.16218/j.issn.1001- 5051.2017.02.013

2016- 12- 09；

2017- 02- 23

甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地开放基金资助项目(ZYZL16- 007)；甘肃省科技计划资助项目(1506RJZA316)；兰州市城关区科技计划项目(2016- 1- 5)

洪 妍(1991-)，女，甘肃兰州人，硕士研究生.研究方向：中药化学成分及药理学.

封士兰.E- mail： fengshl@lzu.edu.cn

R285.5

A

1001- 5051(2017)02- 0201- 05