上海市某高级中学学生结核病疫情的分子流行病学分析

李静 江渊 唐利红 张祖荣 张阳奕 武洁 王莉莉 郁晨蕾 李向群 沈鑫 朱国峰



上海市某高级中学学生结核病疫情的分子流行病学分析

李静 江渊 唐利红 张祖荣 张阳奕 武洁 王莉莉 郁晨蕾 李向群 沈鑫 朱国峰

目的 采用分子流行病学和传统流行病学相结合的方法分析2014年8—9月发生在上海市闵行区某高级中学的结核病聚集性疫情。方法 根据首发患者线索，对该校全体师生分阶段采用肺结核症状筛查和胸部X线摄影检查，胸片有异常阴影者进一步行CT扫描检查，再经临床专家组会诊后筛查出可疑患者进行实验室检查(包括痰涂片、分离培养及GeneXpert MTB/RIF检测)。将收集到的结核分枝杆菌菌株进行“9+3”12个位点(QUB11b、QUB18、Mtub21、MIRU26、QUB26、Mtub04、MIRU31、MIRU40、VNTR2372，VNTR3820、VNTR3232、VNTR4120)结核分枝杆菌可变数目串联重复序列(Mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR)多态性分析。结果 密切接触者中筛查出该校学生中疑似肺结核患者12例，最终确诊肺结核患者11例，其中分枝杆菌培养阳性5例，一线抗结核药物药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果均敏感；GeneXpert MTB/RIF检测4例患者结核分枝杆菌复合群阳性，对利福平敏感。将本次结核病疫情首例患者菌株，以及密切接触者筛查分离培养得到的5株菌株和1株该校2012年11月确诊肺结核患者保存菌株(共7株菌株)进行“9+3”的12个位点MIRU-VNTR基因型分型。结果显示，7例患者9个位点拷贝数均相同；3个高变位点中除1例患者在VNTR3820位点相差1个拷贝数外，其他位点拷贝数均相同。结论 此次学校结核病聚集性疫情中有12例患者确诊为肺结核，其中6例患者的菌株与2012年发病患者的菌株具有同源性。因此，发现学校结核病患者应及时诊断和治疗，同时将分子诊断技术应用到结核病筛查工作中，以尽早控制疫情的发生和蔓延。

结核； 疾病暴发流行； 分子流行病学； 学生

肺结核是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，近年来一直位居上海市传染病报告发病和死亡例数的前列，学生、老年人和流动人口已成为上海市结核病发病的重点人群。学校是学生密集的场所，一旦存在传染源极易发生校园结核病的聚集性发病[1-2]，不仅影响学校正常的教学秩序，更对学生的身心健康和正常发育造成了极大的伤害[3-4]。结核病细菌学诊断常用方法是涂片镜检、固体培养和传统药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。涂片镜检法的敏感度相对较低，传统固体培养和药敏试验耗时较长，均难以实现对结核病患者的早期正确诊断和治疗[5]。随着分子生物学诊断技术的不断发展，分子诊断技术被逐步应用于结核病的早期诊断。2014年8—9月，上海市闵行区某高级中学发生结核病疫情，笔者收集疑似患者的痰样本进行痰涂片、分离培养及GeneXpert MTB/RIF检测，并对分离到的阳性菌株进一步进行菌群鉴定和结核分枝杆菌可变数目串联重复序列多态性分析(Mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR)，采用传统流行病学和分子流行病学相结合的方法分析本次疫情。

资料和方法

一、流行病学调查

1.发现首发患者：患者杨某，于2014年8月23日首次出现咳嗽、咯痰症状，至结核病定点医院就诊；9月1日报告为涂阳肺结核。该患者为上海市某高级中学学生，区级疾病预防控制中心(CDC)发现后与该社区卫生服务中心对患者就读的高级中学展开调查。

2.可疑患者筛查：对该校全体师生分阶段采用肺结核症状筛查和胸部X线摄影检查，如发现胸片有异常阴影，则进一步行CT扫描检查；同时对胸片异常阴影者及其密切接触者进行流行病学调查。

3.患者确诊：结核病诊断依据中华医学会结核病学分会颁布的《肺结核诊断和治疗指南》[6]，结合患者临床症状、胸部X线摄片、CT扫描及实验室检测结果，由临床专家组会诊确诊。

二、实验室检测

对于CT扫描发现异常阴影的患者，留取雾化痰、即时痰、夜间痰送上海市CDC结核病检测实验室进行结核分枝杆菌分离培养，对培养阳性菌株进行药敏试验和菌种鉴定及分子生物学检测。

1.痰涂片检查：按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[7]中的标准化操作程序执行。

2.分离培养：(1)标本前处理。按照《结核病诊断实验室检验规程》操作[8]，采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH法)进行标本处理。用无菌粗口吸管吸取干酪样或脓性痰部分约1～2 ml，移至无菌离心管中。视痰标本性质加入1～2倍量的NALC-NaOH消化液(用时临时配制)，涡旋混匀30 s后室温静置15 min；加入pH值6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)至45 ml，混匀，3000×g离心15 min，倾弃上清液再加入PBS 0.5 ml后，在漩涡振荡器上漩涡离心2～3 s，充分混匀成悬浮液待用。(2)MGIT 960液体培养：接种标本前，在MGIT 7 ml 培养管中加入0.8 ml混合物[取15 ml营养添加剂(OADC)将杂菌抑制剂(PANTA)溶解成混合物]，然后加入0.5 ml标本悬浮液，盖紧MGIT培养管管帽并充分混匀，放置于BACTECTMMGITTM960培养仪器相应的位置进行孵育，等待仪器自动报告结果。当仪器报告显示阳性时，按系统操作步骤提示：取出阳性培养管进行涂片作抗酸染色，确认有抗酸杆菌后则报告分枝杆菌液体培养阳性。阴性培养管应继续培养、检测，培养管判读至42 d，仪器未报阳，可报告分枝杆菌液体培养阴性。

3. GeneXpert MTB/RIF检测：无菌吸管移取1.0 ml痰液至螺旋盖试管中并加入2.0 ml的GeneXpert样品试剂(SR)，在涡旋振荡器上振荡10 s，室温放置15 min，然后使用GeneXpert提供的专用吸管转移样本至专用的样本反应盒(GeneXpert MTB/RIF Car-tridge)，将样本反应盒放入GeneXpert Dx(美国Cepheid公司)仪器的样本舱中，进行DNA提取、PCR扩增和结果的检测，通过专用软件判读结果。

4.药敏试验：参照文献[8]进行，采用文献[9]推荐的比例法，使用罗-琴(L-J)培养基，对4种一线抗结核药物进行药敏试验。抗结核药物的终浓度为：异烟肼(H) 0.2 μg/ml、链霉素(S) 4.0 μg/ml、利福平(R) 40.0 μg/ml、乙胺丁醇(E) 2.0 μg/ml。耐药判定：根据菌落在培养基上生长情况，若含药培养基上生长的菌落数占对照培养基上生长的菌落数的百分率大于1%，则认为受试菌对该抗结核药物耐药。

5.菌群鉴定：采用传统生化法进行鉴定。使用噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基和对硝基苯甲酸(PNB)培养基及28 ℃培养试验进行分枝杆菌菌群鉴定试验。PNB培养基上不生长、TCH培养基上生长或不生长并且28 ℃培养不生长的菌株为结核分枝杆菌复合群；PNB培养基上生长或不生长、TCH培养基上生长和28 ℃培养生长的菌株为非结核分枝杆菌。

6.MIRU-VNTR：参照文献[10]，包括9个位点：QUB11b、QUB18、Mtub21、MIRU26、QUB26、Mtub04、MIRU31、MIRU40、VNTR2372和3个高变位点：VNTR3820、VNTR3232、VNTR4120，利用北京康为世纪生物科技有限公司生产的结核病鉴定试剂盒Ⅱ进行结核分枝杆菌VNTR多态性分析。PCR反应体系和条件参考试剂盒说明书。取1 μl PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳读数：根据各样本扩增条带与Marker相对位置，利用各VNTR位点重复单元读数表及VNTR各位点重复单元电泳图，计算出各菌株在该位点的重复单元数。比较不同菌株9个VNTR位点的重复数进行成簇分析，如果2例(含)以上的患者感染相同9个位点基因型的结核分枝杆菌，初步鉴定为成簇菌株，再加入3个高变位点进一步确认；如果患者分离的菌株具有特异的12个位点基因型，鉴定为单一菌株。以H37Rv标准株作为质控菌株。

结 果

一、流行病学调查结果

2014年9月1日确诊首例涂阳肺结核患者，9月 10日上海市闵行区CDC协助学校组织该校全体243名师生及后勤人员分阶段进行结核病筛查。筛查发现16例胸部X线摄片有异常阴影者，均为学生。进一步CT扫描检查，发现12例肺部有异常阴影，其中，4例伴有空洞形成；最终经专家组会诊后，排除4例，12例不排除肺结核的可能。12例经CT扫描发现异常阴影的疑似肺结核者流行病学调查显示：9例曾经为同班同学，9例住校，8例为暑期班同班同学，1例有既往结核病病史，现已结束疗程。该12例学生的症状体征表现为：8例出现咳嗽症状，其中3例有咯痰，无咯血；2例持续胸痛数日，2例出现发热，1例出现盗汗。对12例CT扫描发现异常阴影者进行密切接触者调查，结果胸部X线摄片未发现有明显异常者。在调查期间获悉，该校有1名学生曾于2012年11月确诊为肺结核，当时进行流行病学调查未发现可疑患者。

二、实验室检查结果

1.细菌学检查：12例CT扫描发现有异常阴影者的痰标本涂片结果均阴性，分离培养得到阳性菌株5株，经PNB和TCH初步鉴定均为结核分枝杆菌复合群，使用16S rRNA基因序列法鉴定为结核分枝杆菌复合群；药敏试验结果显示，5株分离株对H、S、E、R等一线抗结核药物均敏感。

2. GeneXpert MTB/RIF检测：12例CT扫描发现有异常阴影者的痰标本中共检测出4例结核分枝杆菌复合群阳性，对R敏感，其余8例未检出。此4例GeneXpert MTB/RIF检测阳性患者的痰培养也均为阳性。

3.MIRU-VNTR基因型检测：将本次结核病疫情首例患者菌株，以及密切接触者筛查到的12例CT扫描发现肺部异常阴影可疑者的痰标本分离培养阳性的5株菌株和1株2012年11月确诊肺结核患者的保存株(共7株菌株)进行MIRU-VNTR基因型分型。7例患者9个位点拷贝数均相同，3个高变位点除1例患者VNTR3820位点相差1个拷贝数外，其他位点拷贝数均相同，见表1。

4.患者确诊：采用肺结核症状和影像学检查共筛查到12例肺部有异常阴影的可疑患者，经临床专家组会诊，结合患者临床症状、影像学及实验室检测结果，共确诊11例肺结核患者。由此，加上首例患者，本次该学校结核病疫情共发现12例肺结核患者。

讨 论

学校是典型的群体环境，人群密集、接触密切，存在结核病暴发流行的风险，尤其是在通风条件较差，出现传染源后更易造成集团感染[4]。本次疫情中首发患者为涂阳肺结核，其所在校舍基本为全封闭状态，导致多名同班或同寝室同学感染肺结核。除首发患者外，12例疑似肺结核患者根据临床症状、实验室检测结果和影像学资料，有11例患病学生临床诊断为肺结核。将收集到的阳性培养物进行MIRU-VNTR基因分型分析，结果显示本次发病的6例患者菌株的基因型与2012年发病患者一致，具有同源性，可能存在近期传播关系。

表1 7例患者分离株12个位点MIRU-VNTR基因分型结果(重复拷贝个数)

目前，结核分枝杆菌VNTR分型技术已经广泛应用于结核病流行病学调查[11-12]。Supply等[13]于2006年提出的15或24位点VNTR是目前应用最多的方案，但该方案对我国高度流行的北京家族菌株的分辨率较低[10]。本次调查采用Luo等[10]在2014年建立的适合中国结核分枝杆菌临床菌株特征的分型方案，一套位点数少且分辨率高的“9+3”VNTR位点组合。7株分离株中在9个位点上的扩增目的片段大小完全一致，拷贝数一致，在3个高变位点上6株拷贝数一致，1株在VNTR3820位点仅相差1个拷贝数。本次采用的高变位点VNTR3820、3232和4120等虽然存在扩增产物分子量较大而不宜准确判读，但由于其具有较高分辨率而被纳入二线分型方案中[10]。高变位点相对比较稳定，但在少数患者体内还是存在变异[10]。本次研究结果中，1例患者在VNTR3820高变位点相差1个拷贝数，很有可能为这例患者在体内发生了微进化，从而导致重复片段与其他患者不一致。对此结果，笔者将在后续工作中应用全基因组测序的方法进一步研究。一般情况下，高变位点中只有1个位点相差1～2个重复拷贝，可以判定为成簇，因此本次疫情获得的6株分离株属于同一个簇，且2012年发病的患者菌株也属于该簇，所有患者药敏试验结果均相同，结合传统流行病学调查，笔者初步判断此次暴发的结核分枝杆菌菌株可能来源于2012年的结核病患者。

2012年11月发病并确诊肺结核的患者陈某为该校高一学生，当时进行了流行病学调查并做相应检查未发现有新的可疑结核病患者。本次2014年首发患者为陈某高一时同班同学，两人均为涂阳结核病患者，两者发病间隔时间近2年。李建翠等[11]报道了一起菌阳结核病患者引起某中学结核病聚集性疫情，说明涂阳或菌阳结核病患者在通风条件较差的环境下相比涂阴或菌阴结核病患者更易发生传播，如不及时发现并及时诊断和筛查，可能使疫情进一步恶化。人感染结核分枝杆菌后仅有部分人会发生结核病，而且从感染到发病需要一定时间，笔者建议对于涂阳患者周围人群进行定期随访，改善教室通风环境，并进行结核病健康知识宣传，以尽早发现传染源，减少发生新的患者，从而降低结核病疫情发生的风险。

结核病从发病到确诊需要一个较长的时间，早发现、早诊断是阻止结核病疫情暴发和蔓延的关键。笔者认为，除了要重视结核病疫情苗头监测工作外[14]，建议将分子诊断技术引入结核病疫情的早期诊断。本次疫情采用了GeneXpert MTB/RIF检测，该技术被WHO推荐用于检测结核病和R耐药[15]。相比传统的细菌学检查方法，GeneXpert MTB/RIF检测仪器自动完成从结核分枝杆菌DNA提取、扩增、产物检测到结果报告[16]；除标本前处理外，整个检测均在封闭的反应盒内进行，可有效避免实验中的交叉污染造成的假阳性。相对涂片、培养药敏试验等检测，该检测对实验室生物安全要求较低，结果报告时间(2.5 h)大大缩短，且敏感度和特异度高，进而能更好地辅助临床医生对肺结核、尤其对于菌阴肺结核患者进行早期诊断和治疗[5]。本次疫情中的12例疑似结核病患者均为涂阴肺结核，4例经GeneXpert MTB/RIF检测结果为阳性，为临床早期确诊肺结核提供了实验室诊断依据。

本研究从分子流行病学角度分析此次学生肺结核疫情，为学校结核病疫情的流行病学调查提供了重要的实验室依据，提示学校内结核病传染源的传播风险非常高[12]。因此，要严格按照《上海市学校结核病防控工作规范(试行)》执行；加强学校结核病防治知识的健康教育和宣传工作，预防学校结核病的发生，提高社会公众对结核病防治知识的了解[3]；做好新生入学体检及各年级学生的健康监测和体检，发现学校有可疑结核病患者应及时进行诊断和治疗，同时将结核病分子诊断技术应用到结核病筛查工作中，以尽早控制学校结核病疫情的发生和蔓延。

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(本文编辑：李敬文)

Analysis of tuberculosis aggregation epidemic in a senior high school in Shanghai using molecular epidemiology method

LIJing*,JIANGYuan,TANGLi-hong,ZHANGZu-rong,ZHANGYang-yi,WUJie,WANGLi-li,YUChen-lei,LIXiang-qun,SHENXin,ZHUGuo-feng.

*TuberculosisLaboratory,ShanghaiMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai200336,China

s:SHENXin,Email:shenxin@scdc.sh.cn;ZHUGuo-feng,Email:zhugf2014@126.com

Objective To analyze the tuberculosis (TB) aggregation epidemic in a senior high school in Minhang District of Shanghai between August 2014 and September 2014, using the molecular and traditional epidemiological survey. Methods Because of the first episode, all the teachers and students in the school were performed symptom screening and chest X-ray, and then chest CT scan were performed on the chest X-ray abnormal cases. The suspected TB cases were tested with sputum smear, liquid culture and GeneXpert MTB/RIF. TheMycobacteriumtuberculosis(MTB) isolates were genotyped by 12-loci (9+3) Mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat (MIRU-VNTR; includingQUB11b,QUB18,Mtub21,MIRU26,QUB26,Mtub04,MIRU31,MIRU40,VNTR2372,VNTR3820,VNTR3232,VNTR4120). Results A total of 12 suspected cases were screened among the close-contact students. Finally, 11 cases were definitely diagnosed of TB, among which 5 cases were MTB cultured positive and were sensitive to first-line anti-TB drugs. Of the 12 cases, 4 cases were positive in MTB culture and sensitive to rifampin, using GeneXpert MTB/RIF assay.Six strains of MTB isolated from this school TB aggregation epidemic and the strain isolated from a TB student from this school in November 2012 were genotyped by 12-loci MIRU-VNTR. It was found that 9 locies had the same VNTR pattern; as to the other 3 hypervariable sites, only 1 case had single-locus variant inVNTR3820 locus which was regarded as hypervariable loci. Conclusion A total of 12 pulmonary TB cases were identified in this school, 6 clinical isolates of which were homologous to the MTB of the TB patient which were reported in November 2012. Hence, the timely diagnosis and effective treatment once finding the student TB cases is important in school TB prevention. It was suggested that the application of the rapid diagnostic techniques to screen close-contact students may be benefit to prevention of TB epidemic situation in schools.

Tuberculosis; Pandemics; Molecular epidemiology; Students

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.018

上海市卫生和计划生育委员会科研课题青年项目(20144Y0063)

200336 上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室(李静、江渊、张阳奕、武洁、王莉莉、郁晨蕾、朱国峰)，结核病防治科(张祖荣、李向群、沈鑫)；上海市闵行区疾病预防控制中心结核病防制科(唐利红)

沈鑫，Email：shenxin@scdc.sh.cn；朱国峰，Email：zhugf2014@126.com

2016-09-20)