怀牛膝多糖的微波提取工艺研究

郭婕，李季平，刘中华

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口 466001）

怀牛膝多糖的微波提取工艺研究

郭婕，李季平，刘中华

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口 466001）

怀牛膝多糖是常用中药牛膝中的主要活性成分，可作为一种免疫调节剂，是重要的多糖药物之一。本实验采用微波辅助法提取怀牛膝中多糖，溶剂为水，采用苯酚-硫酸比色法测定怀牛膝多糖含量，通过单因素及正交试验研究微波功率、料液比、提取温度和微波作用时间对怀牛膝多糖提取率的影响。结果表明，怀牛膝多糖微波提取的最佳工艺条件为：微波功率为600W、料液比1:20（g/mL）、浸取温度为70℃、微波处理时间4min。

怀牛膝；多糖；微波提取

怀牛膝（Achyranthes bidentataB1）为苋科植物牛膝的干燥根[1]，属四大怀药，具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋的作用，其中含有丰富的水溶性多糖。怀牛膝多糖是从怀牛膝根中提取、分离、纯化得到的一种小分子水溶性的多糖化合物，是常用中药牛膝中研究的较为透彻的活性成分，可作为一种免疫调节剂。现代药理学研究证实怀牛膝多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及多种免疫调节作用[2]，已成为重要的多糖药物之一。怀牛膝多糖与牛膝寡聚糖相比，免疫性更强。

怀牛膝多糖常见的提取方法，往往存在有效成分损失大、工序复杂、提取周期长、提取率较低等缺点。微波射线穿透性极好，能充分保护有效成分，对热敏性成分的浸提极为有效。微波提取具有选择性好、操作简便、提取周期短、能耗低、提取率高等特点。微波提取在药物成分提取及食品加工行业应用广泛[3]。因此，本实验以怀牛膝为研究材料，利用微波技术研究了微波功率、料液比、提取温度和微波作用时间对怀牛膝多糖提取率的影响，采用单因素实验及正交实验，考察了怀牛膝多糖提取工艺的最佳参数组合。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

怀牛膝，购于同和堂大药房。

葡萄糖、氯仿、正丁醇、乙醚、98%浓硫酸均购于天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇，购于天津市富宇精细化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 样品处理

准确称取粉碎的怀牛膝4g，置于干净的锥形瓶中，按照料液比向锥形瓶中加入蒸馏水浸泡1h，微波提取2次，合并提取液，按照5∶1的比例在合并液中加入氯仿∶正丁醇=5∶1混合液后充分摇匀，4000r/min离心10min除去蛋白质，将上清液置于90℃的烘箱中浓缩。取出浓缩液，冷却，按照浓缩液与乙醇比为1∶3的比例加入95%乙醇，沉淀。然后搅拌均匀，静止过夜，4000r/min离心15min，取沉淀，用乙醚洗涤沉淀，即为怀牛膝多糖粗提物[4]。

1.3 测定方法

本实验采用苯酚-硫酸比色法测定怀牛膝多糖含量。将怀牛膝多糖粗提物置于干净的锥形瓶中，向其中加入200mL蒸馏水，取1mL作为待测液测其吸光度。根据回归方程算出测量液多糖浓度C0（μg/mL），按照以下公式计算怀牛膝多糖的提取率（mg/g）。

式中：C0，测量液多糖浓度，μg/mL；

V，粗提取液体积，mL；

K，为稀释倍数；

W，原料干重，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

多糖含量采用苯酚-硫酸法测定[5]，以葡萄糖为标准品。标准方程式为y=0.027x-0.0094，R2=0.9946，y为吸光度，x为葡萄糖浓度（μg/mL）。

2.2 单因素实验

2.2.1 微波功率对怀牛膝多糖提取率的影响

在料液比为1∶20（g/mL）、温度为80℃、微波处理时间2min的条件下，研究不同微波功率（150W、300W、 450W、600W、750W）对怀牛膝多糖提取率的影响，实验结果见图1。

图1 微波功率对怀牛膝多糖提取率的影响

由图1可知，随着微波功率的提高，怀牛膝多糖的提取率起初随之升高；当微波功率达到450W时，多糖的提取率最高为12.64%，但是随着微波功率的继续提高，多糖的提取率反而略有下降。这可能是因为微波功率过低，温度低，浸提不完全；微波功率过大时，加热温度太高，可能会破坏多糖的结构[6]，对提取多糖不利。因此，本试验选取450W为微波提取功率。

2.2.2 料液比对怀牛膝多糖提取率的影响

在微波功率300W、温度为80℃、微波处理时间2min的条件下，研究不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）对怀牛膝多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对怀牛膝多糖提取率的影响

由图2可知，怀牛膝多糖提取率随着料液比的减少呈现先升高后降低的趋势，料液比为1∶20（g/mL）时，怀牛膝多糖提取率达到最高，为17.0%。分析原因可能在于溶剂用量影响有效成分浸出液的浓度，从而影响到原料内部与外部之间成分的扩散过程。料液比太大，提取不完全；料液比太小，回收、过滤、转移困难，造成浪费，并且后期浓缩成本高。本试验选取1∶20（g/mL）的料液比。

2.2.3 提取温度对怀牛膝多糖提取率的影响

在微波功率为300W、料液比为1∶20（g/mL）、微波处理时间2min条件下，研究不同微波提取温度（室温、60℃、70℃、80℃、90℃）对怀牛膝多糖提取率的影响，实验结果见图3。

图3 提取温度对怀牛膝多糖提取率的影响

由图3可知，在设置温度内怀牛膝多糖提取率随着温度的升高逐渐上升，提取温度为80℃时，多糖提取率最高，之后呈下降趋势。温度较低时，以水作为溶剂萃取多糖，效率比较低，随着温度的升高，多糖的提取率增加[7]，而温度过高时，多糖成分被破坏而使提取率下降。本试验选取提取温度为80℃。

2.2.4 微波处理时间对怀牛膝多糖提取率的影响

经过预实验得知微波处理时间对怀牛膝多糖的提取率有很大影响。在微波功率为300W、料液比为1∶20（g/mL）、温度为80℃的条件下，研究不同微波处理时间（1min、2min、3min、4min、5min）对怀牛膝多糖提取率的影响，实验结果见图4。

由图4可知，微波处理时间在3min时对怀牛膝多糖的提取率最高，随着微波加热时间的增加多糖提取率反而下降。微波处理时电磁波把能量直接传播到怀牛膝根内部，使之瞬间加热，怀牛膝根内多糖分子运动迅速加剧，向外部溶液扩散运动急剧增加，产生爆沸，导致水分迅速流失，水分中的多糖分子也由于温度的瞬间上升导致其结构被破坏；当微波提取一定的时间后，怀牛膝多糖完全溶解出来，但随着提取时间的延长，温度升高，一部分多糖被破坏，从而导致微波提取曲线先升后降。因此，本试验选取微波时间为3min。

图4 微波时间对怀牛膝多糖提取率的影响

2.3 微波条件的正交优化

为了确定微波功率、料液比、微波时间、提取温度共同作用对怀牛膝多糖提取率的影响，得到微波提取怀牛膝多糖工艺的最佳条件，在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交表对以上因素进行正交试验。因素水平安排见表1，实验结果见表2（表2见下页）。

由表2可知，通过正交试验结果极差分析，影响怀牛膝多糖提取率的几个因素顺序为：D＞B＞C＞A，即微波时间＞料液比＞提取温度＞微波功率；微波提取怀牛膝多糖的最佳工艺条件为：A3B2C1D3，即微波功率600W、料液比1∶20（g/mL）、浸取温度70℃、微波处理时间4min。此工艺条件下，怀牛膝多糖的提取率为12.37%，均优于其他实验组。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验结果

3 结论

本实验采用苯酚-硫酸比色法测定怀牛膝多糖含量，其原理是多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，此糠醛衍生物与苯酚缩合生成有色化合物。本法简单快速，灵敏度高，重现性好，可为怀牛膝资源的开发及应用提供相关参考依据。怀牛膝作为驰名中外的“四大怀药”之一，具有巨大的开发潜力。

本文通过对怀牛膝多糖提取工艺的筛选优化，确立了怀牛膝多糖微波提取工艺条件：微波功率600W、料液比1∶20（g/mL）、浸取温度为70℃、微波处理时间4min。在此工艺条件下，怀牛膝多糖的提取率为12.37%。其工艺条件为怀牛膝多糖进一步研究做了前期准备，具有一定的实践指导意义。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京∶化学工业出版社,2005∶49.

[2]宋义平,刘彩玉,周刚,等.牛膝多糖对小鼠细胞免疫功能的影响[J].中药新药与临床药理,1998,9(3)∶158-159.

[3]夏光辉,王晓雅,李冰.微波技术在果蔬加工中的应用研究进展[J].中国果菜,2016,36(7)∶4-8.

[4]郭婕,胡春红,袁淑培,等.车前草多糖微波提取工艺研究[J].食品工业科技,2014,35(16)∶223-225,230.

[5]陈钧辉,李俊,张太平,等.生物化学实验 [M].科学出版社, 2008,15.

[6]李永裕,陈建烟,关夏玉,等.微波辅助提取余甘多糖的工艺研究[J].海峡科学,2010,(10)∶210-213.

[7]黄琨,黄少伟,池汝安.微波辅助提取葛根多糖工艺研究[J].中国民族民间医药杂志,2008,17(2)∶1-3,25.

Microwave Extraction Technology of Polysaccharide fromAchyranthes bidentataPolysaccharide

GUO Jie,LI Ji-ping,LIU Zhong-hua
(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

Achyranthes bidentatapolysaccharide is one of the main active ingredient in traditional Chinese medicine Achyranthes bidentata,and it is one of the most important polysaccharide drugs,which can be used as an immunomodulator.Microwave extraction was used to extract polysaccharide from Achyranthes bidentata in this article, using water as solvent.The influence factors on extraction yield were studied by single factor and orthogonal experiment, which included microwave power,the solid-liquid ratio,extraction temperature and microwave-heating time.The results showed that the optimal conditions were as follows:microwave power 600W,the 1:20(g/mL)ratio of solid to liquid, extracting at 70℃for 4min.

Achyranthes bidentata;polysaccharide;microwave extraction

O657 O426.5

A

1008-1038(2017)04-0016-04

2016-12-06

2015年河南省高等学校重点科研项目（15A180065）

郭婕（1984—），女，讲师，主要从事天然药物化学研究