鱼油纳米乳的制备及贮藏稳定性研究

郑景霞，白春清，陆天洋，王 蕊，赵 利，熊 华

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047； 2.江西科技师范大学生命科学学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，南昌 330013)

鱼油纳米乳的制备及贮藏稳定性研究

郑景霞1，白春清2，陆天洋2，王 蕊2，赵 利2，熊 华1

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047； 2.江西科技师范大学生命科学学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，南昌 330013)

采用高压均质法，以乳清分离蛋白(WPI)乳化包埋鱼油制备鱼油纳米乳。采用单因素实验研究了主要因素对包封率和吸光比(SRI)的影响，并以包封率为指标，进行正交实验优化工艺配方。同时以不同压力处理的鱼油纳米乳为对照，分别考察了4、25℃条件下鱼油纳米乳的贮藏稳定性。结果表明：最佳工艺配方为乳清分离蛋白质量浓度25 g/L，鱼油添加量100 g/L，均质压力80 MPa，均质次数4次。采用最佳工艺配方制备的鱼油纳米乳的包封率为96.4%，SRI为0.113。稳定性实验结果表明鱼油经纳米乳包埋可显著提高鱼油氧化稳定性，高压处理有利于提高鱼油纳米乳的稳定性，鱼油纳米乳在4℃的贮藏稳定性高于25℃的贮藏稳定性，80 MPa处理鱼油纳米乳经4、25℃放置30 d乳析指数分别为0、1.4%，鱼油纳米乳经25℃放置60 d后过氧化值及渗漏率分别为4.25 meq/kg、5.89%。

鱼油；纳米乳；制备；稳定性

二十碳五烯酸(EPA)具有降血压，缓解疲劳，预防动脉粥样硬化、脑血栓等活性；二十二碳六烯酸(DHA)具有改善大脑机能，提高记忆力等生理功能[1-2]。国际脂肪酸和脂类研究学会建议成年人DHA和EPA的摄入总量为500 mg/d，美国医学研究院建议成年人DHA和EPA的摄入量为160 mg/d，而我国居民的摄入量处于严重缺乏状态，仅为37.6 mg/d[3]。鱼油因含有大量的DHA、EPA等多不饱和脂肪酸，是目前DHA、EPA最重要的补充来源之一，受到各界的广泛重视，并引发了开发鱼油产品的热潮。但鱼油自身的一些缺陷限制了其应用：①鱼油中大部分脂肪酸都是不饱和脂肪酸，容易氧化分解，产生醛、酮等对人体有害的物质；②鱼油水溶性差，生物利用率低[3-4]。因此，开发稳定的载体以改善鱼油水溶性，提高稳定性是解决上述问题、拓展其应用的关键。

纳米乳，又称纳米乳液、纳米乳状液、纳米乳剂等，大多由水相、油相、表面活性剂等成分按适当比例混合后经一定能量输入(搅拌、均质、分散、超声等)形成的纳米级包埋体系[5]。作为新型活性物质载体，纳米乳具有不可比拟的优点：热力学稳定，可过滤灭菌，易于保存；提高油溶性和水难溶性物质的溶解度；是目前食品、药学及化妆品领域的研究热点[5-7]。乳化材料的选择是纳米乳制备的关键。近年来，蛋白质因营养丰富，具有良好的乳化活性，受到研究者的普遍关注。乳清蛋白作为母乳中的重要蛋白质，研究发现其安全无毒，消化利用率高，且具有良好的乳化活性，成为目前制备纳米乳的首选[8]。

但作为非均衡系统，纳米乳不可自发形成，而需要一定的能量输入以获得均相分散体系[9]。高压均质技术是一种非常特殊的机械力化学技术, 可以让物料在高压腔内受到空穴爆炸、高频振荡、强烈剪切和高速对流撞击等多重机械力作用，物料瞬间发生乳化、细化，提高物料稳定性[9-10]。高压均质法与常规乳化处理使用的超声法相比具有样品处理量大、可以连续化生产、生产强度大、稳定性高等优点。

综上，本研究拟以乳清分离蛋白(WPI)替代合成表面活性剂对鱼油进行乳化包埋，采用高压均质处理，提高体系的稳定性，优化工艺配方，并评价其贮藏稳定性，为开发高端鱼油产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

鱼油，西安康隆化工有限公司；乳清分离蛋白 (蛋白质含量91%～92%)，Glanbia公司；石油醚、异辛烷、异丙醇、硫氰酸钾均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

BSA224S-CW型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；T25高速剪切乳化机，德国IKA集团；NS1001L2K高压均质机，Niro Soavi S.P.A公司；JB-3型磁力搅拌器，上海雷磁新径仪器有限公司；UV-2600紫外分光光度计，上海仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼油纳米乳的制备

按照实验配方称取一定量的鱼油和乳清分离蛋白，用pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解乳清分离蛋白，配制一定质量浓度的乳清分离蛋白溶液，边搅拌边加入一定质量的鱼油后，经高速剪切乳化机在20 000 r/min条件下乳化2 min得粗乳液。将粗乳液在一定压力下循环均质处理得鱼油纳米乳。

1.2.2 包封率及渗漏率的测定

取20 mL鱼油纳米乳，加入15 mL石油醚，振荡1 min，静置分层。重复萃取3次，将收集到的有机相置于烧瓶(称重W1)中，60℃烘干至恒重，于干燥器中冷却，称重(W2), 干燥前后质量差(W2-W1)，即表面油含量，进而计算包封率。渗漏率通过测定贮藏过程中鱼油的包封率来确定[11]。

包封率=[1-(表面油/总油)]×100%；

渗漏率=[1-(贮藏过程中乳液包封率/贮藏初期乳液包封率)]×100%。

1.2.3 吸光比测定

室温下，用蒸馏水将新鲜的鱼油纳米乳稀释1 000 倍以后，分别在400、800 nm波长下测其吸光度A，用吸光比SRI=A800/A400表示鱼油纳米乳的稳定性，当SRI小于0.3时说明鱼油纳米乳比较稳定[11]。

1.2.4 乳析指数的测定

将10 mL新鲜鱼油纳米乳移至直径为20 mm、高度为100 mm带盖平底玻璃试管中静置，定期测量其分层后底部清液层的高度。乳析指数越大分层现象越明显，表示乳液越不稳定[12-13]。

乳析指数 =清液层高度/样品的总高度×100%。

1.2.5 过氧化值的测定

过氧化值的测定，采用硫氰酸铁法[13]。取1 mL鱼油纳米乳于离心管中，加入5 mL体积比为2∶1的异辛烷和异丙醇的混合物，充分振荡30 s，然后进行离心，取上层清液200 μL，加入硫氰酸钾二价铁离子溶液，用甲醇-丁醇(体积比2∶1)定容到5 mL，避光反应20 min后，于510 nm波长下测定吸光度，通过Fe3+标准曲线计算样品中过氧化物浓度。

1.2.6 数据的统计处理

实验数据采用Origin 8.0软件进行绘图，数值以3次实验的“均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 均质压力对鱼油纳米乳的影响

固定WPI质量浓度50 g/L，鱼油添加量100 g/L，均质次数3次，考察均质压力(0、30、50、70、90、110、130 MPa)对鱼油纳米乳SRI及包封率的影响，结果如图1所示。

图1 均质压力对鱼油纳米乳包封率及SRI的影响

由图1可知，在一定均质压力范围内鱼油纳米乳的包封率与均质压力呈正比。但在均质压力超过一定范围后，随均质压力的增大包封率反而有所下降，且在90 MPa附近出现最大值。当均质压力在0～90 MPa范围内随着均质压力的增大SRI逐渐降低，即稳定性提高；当均质压力为110～130 MPa时SRI有所增大，即稳定性降低。高压均质过程是能量的输入过程，均质压力越大，乳液受到的作用力越大，乳液乳化、细化越明显，所形成纳米乳粒径越小且均一，即有利于形成均相分散体系，稳定性提高。但均质压力过大时，容易造成分散的液滴破碎，出现包埋物渗出，一方面引起包封率下降，另一方面导致乳液中出现一些聚集物，大颗粒的出现导致均相体系被破坏，稳定性下降SRI升高。因此，选择均质压力为80、90 MPa和100 MPa开展后期实验。

2.1.2 均质次数对鱼油纳米乳的影响

固定WPI质量浓度50 g/L，鱼油添加量100 g/L，均质压力90 MPa，考察均质次数(1、2、3、4、5次)对鱼油纳米乳SRI及包封率的影响，结果如图2所示。

图2 均质次数对鱼油纳米乳包封率及SRI的影响

由图2可知，当均质次数在1～3次范围内，随着均质次数的增多，包封率快速升高；均质处理4次与3次相比，包封率稍有下降但差异不大；当均质次数为5次时，包封率明显降低。SRI与包封率的变化呈相反的趋势，随着均质次数的增多先降低后升高，并在均质次数为4次时出现拐点。前期包封率的增加及稳定性提高，可能是循环均质处理有利于WPI乳化形成更多粒径均一的纳米乳，包埋更多鱼油的同时提高其稳定性。后期包封率的降低可能是多次均质处理导致机械产热，破坏已经形成的乳液，引起包封率的降低，而包封率的降低意味着更多的鱼油粘附在纳米乳表面，在提高乳液亲油性的同时引发纳米乳间的粘连，产生聚集物，破坏稳定性。综上所述，选择均质次数为2、3次和4次开展后期实验。

2.1.3 WPI质量浓度对鱼油纳米乳的影响

固定鱼油添加量100 g/L，均质压力90 MPa，均质次数3次，考察WPI质量浓度(5、10、15、20、25、40、60 g/L)对鱼油纳米乳SRI及包封率的影响，结果如图3所示。

图3 WPI质量浓度对鱼油纳米乳包封率及SRI的影响

包埋材料的添加量不仅会影响到鱼油用量的多少，还会影响到整个纳米乳体系的稳定性，对制备高包封率且稳定的鱼油纳米乳起着至关重要的作用[8]。由图3可知，在WPI质量浓度5～20 g/L范围内，随着WPI质量浓度的增加，包封率呈直线上升趋势，SRI也快速降低；而在WPI质量浓度20～60 g/L范围内随着WPI质量浓度的增加，包封率有所上升但变化不大，SRI也几乎维持在同一水平。当WPI质量浓度较低时包封率较低，且稳定性差，这可能是因为在较低质量浓度下，少量的WPI乳化能力有限不能将添加的鱼油进行有效包埋，即存在一定量的鱼油粘附在纳米乳表面或游离于分散介质中，易导致乳液分层、液滴聚集，稳定性差；当WPI质量浓度提高后，可将绝大多数鱼油进行包埋，并在均质处理的条件下乳化形成均相分散体，稳定性提高，包封率升高；当WPI质量浓度在20 g/L及以上时，其自身乳化能力达到饱和，过量的WPI直接分散在介质中，对包封率及SRI几乎不构成影响。且当WPI质量浓度超过20 g/L以后，包封率几乎达到最大值，此时SRI低于0.2，说明制成的鱼油纳米乳较稳定。因此，WPI质量浓度选择15、20、25 g/L进行后期实验。

2.1.4 鱼油添加量对鱼油纳米乳的影响

固定WPI质量浓度为50 g/L，均质压力90 MPa，均质次数3次，考察鱼油添加量(10、50、100、150、200、250 g/L)对鱼油纳米乳SRI及包封率的影响，结果如图4所示。

图4 鱼油添加量对鱼油纳米乳包封率及SRI的影响

由图4可知，随着鱼油添加量的增大包封率呈降低趋势，而SRI呈上升趋势，即稳定性呈下降趋势，表明鱼油的添加对鱼油纳米乳的质量产生负面影响。当鱼油添加量在10～100 g/L范围内，SRI及包封率虽分别有所升高和降低，但相对都比较平缓。但当鱼油添加量大于100 g/L后，随着鱼油添加量的增加，包封率及稳定性降低趋势都较为明显。因此，鱼油添加量选择50、100、150 g/L进行后期实验。

2.2 正交实验

在单因素实验基础上，以包封率为指标对各因素进行正交实验，因素水平见表1，正交实验结果见表2。

表1 因素水平

表2 正交实验结果

由表2可知，各因素对鱼油纳米乳的影响顺序是：鱼油添加量>WPI质量浓度>均质次数>均质压力，制备鱼油纳米乳的最佳工艺配方是A1B3C3D1。即当均质压力为80 MPa，均质次数为4次，WPI质量浓度为25 g/L，鱼油添加量为50 g/L时得到的鱼油纳米乳包封率最高。因鱼油添加量50 g/L和100 g/L时，鱼油纳米乳的包封率相差不大，为了提高鱼油的载量，所以选定最佳的配方为均质压力80 MPa，均质次数4次，WPI质量浓度25 g/L，鱼油添加量100 g/L。按此工艺所制备的鱼油纳米乳的包封率为96.4%，SRI为0.113。

2.3 鱼油纳米乳的稳定性

2.3.1 乳析指数

本研究以0、30 MPa均质处理得到鱼油纳米乳为对照，考察80 MPa均质处理所得最佳配方样品在不同温度下贮藏30 d的乳析指数变化，以评价产品的稳定性，结果如表3所示。乳析指数越大表示乳液越不稳定。

表3 鱼油纳米乳乳析指数在贮藏期间的变化

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表3可知，不同均质压力处理所得鱼油纳米乳经同一温度(4℃或25℃)贮存，乳析指数间有较大的差异，但随着贮藏时间的延长都呈增长趋势，即贮藏时间越长稳定性越差，且贮藏末期几乎所有样品都出现了不同程度的分层现象；经同期同温度贮藏后，80 MPa均质压力处理下所得鱼油纳米乳乳析指数最低，30 MPa均质压力处理下所得鱼油纳米乳较高，0 MPa均质压力处理下所得鱼油纳米乳乳析指数最高，说明均质处理有利于提高鱼油纳米乳贮藏期间的物理稳定性。同时也发现，经相同均质压力处理样品在4℃贮藏样品的乳析指数低于25℃下的，即低温有利于维持体系的稳定。高均质压力处理组的稳定性高于低均质压力及无均质压力处理组，可能是经80 MPa处理样品的粒径较小，一定程度上克服贮藏过程中由于重力和布朗运动产生液滴聚合，从而延缓分层、沉降和絮凝问题的出现；但在重力耦合作用下，长期放置，随着液滴膜接触时间的延长，可能加速合并，导致不稳定问题；同时本研究在最佳工艺下制备的鱼油纳米乳粒径在200 nm左右，且黏度较低，不可避免地会受到奥斯特瓦尔德熟化的影响，产生较大液滴；即经80 MPa处理组在放置末期也会出现分层现象。而高温贮藏组稳定性低于低温贮藏组，可能是高温加速液滴布朗运动，促进液滴聚合所致。

2.3.2 过氧化值

油脂及其制品过氧化值的测定是判断其氧化、酸败程度的重要指标[14-16]。鱼油中含有大量的不饱和脂肪酸，易氧化分解产生氢过氧化物，本研究以鱼油为对照通过定期测定鱼油纳米乳的过氧化值，评价纳米乳对鱼油的氧化保护作用, 结果如图5所示。

由图5可知，在25℃贮藏60 d期间，所有样品的过氧化值都有所上升，但鱼油的上升幅度明显高于鱼油纳米乳，且鱼油样品的过氧化值普遍高于同期鱼油纳米乳的，说明鱼油经WPI包埋可提供一定的屏障作用，减少外界对鱼油的影响，延缓鱼油的氧化。同时也发现0～40 d 内鱼油过氧化值升高相对较慢，而40 d后过氧化值快速升高。这可能是前期鱼油处于较长的油脂氧化引发期内，而一旦体系中产生了自由基，则发生快速氧化，产生大量的过氧化物。而在整个贮藏期间鱼油纳米乳的过氧化值升高较为平缓，这可能是因为鱼油纳米乳的包封率较高，即仅有少量的鱼油粘附在纳米乳或分散在介质中，由外界影响而引发的游离鱼油的氧化分解所产生的自由基并不能穿过WPI屏障引发包埋内部鱼油的氧化。

图5 贮藏过程中过氧化值的变化

2.3.3 渗漏率

渗漏率是评价载体稳定性主要指标之一，渗漏率越高表示越多的包埋物游离出来，载体对功能性成分的保护作用越差[16]。本研究以渗漏率为指标考察了最佳配方工艺条件制备的鱼油纳米乳在25℃条件下贮藏60 d稳定性，结果如图6所示。

图6 鱼油纳米乳贮藏期间渗漏率的变化

由图6可知，随着贮藏时间的延长，鱼油纳米乳的渗漏率缓慢增加，前40 d鱼油纳米乳的渗漏率较低且增长较慢，40～60 d时鱼油纳米乳的渗漏率有较大的提升，但渗漏率相对来说比较低。

3 结 论

本研究经单因素实验和正交实验得到鱼油纳米乳的最佳工艺配方为：乳清分离蛋白质量浓度25 g/L，鱼油添加量100 g/L，均质压力80 MPa，均质次数4次。采用最佳工艺配方制备的鱼油纳米乳的包封率为96.4%，SRI为0.113。鱼油经纳米乳包埋可显著提高鱼油氧化稳定性，高压处理有利于提高鱼油纳米乳的贮藏稳定性，但高温贮藏可加速乳液聚集分层。

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Preparation and storage stability of fish oil nano-emulsion

ZHENG Jingxia1, BAI Chunqing2, LU Tianyang2, WANG Rui2, ZHAO Li2, XIONG Hua1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2.National R & D Branch Center for Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

Fish oil nano-emulsion was prepared from whey protein isolate (WPI) and fish oil by high pressure homogenization method. The effects of major factors on the encapsulation efficiency and absorption ratio (SRI) were studied by single factor experiment. The orthogonal experiment was applied to obtain the optimal conditions with encapsulation efficiency as index. At the same time, the storage stabilities of fish oil nano-emulsion at 4,25℃ were investigated with fish oil nano-emulsions treated by different pressures as control. The results indicated that the optimal conditions were obtained as follows: WPI mass concentration 25 g/L, dosage of fish oil 100 g/L, homogenization pressure 80 MPa and homogenization times 4. Under the optimal conditions, the encapsulation efficiency andSRIof fish oil nano-emulsion were 96.4% and 0.113, respectively. The stability test results showed that the oxidation stability of fish oil was significantly improved after being encapsulated in nano-emulsion, and the stability of fish oil nano-emulsion could be enhanced by high pressure treatment. Also the storage stability of fish oil nano-emulsion at 4℃ was better than that at 25℃. The creaming indexes of fish oil nano-emulsion treated under pressure 80 MPa after 30 d storage at 4℃ and 25℃ were 0 and 1.4%, respectively, and the peroxide value and leakage rate of fish oil nano-emulsion stored at 25℃ for 60 d were 4.25 meq/kg and 5.89%, respectively.

fish oil; nano-emulsion; preparation; stability

2016-07-21；

2017-01-11

国家自然科学基金委员会资助项目(31560465)；江西省教育厅青年项目(GJJ150803)；江西省自然科学基金资助项目(20161BAB204190)；农业部水产品加工重点实验室开放基金(NYJG201501)

郑景霞 (1992)，女，硕士研究生，研究方向为功能性成分载体研究与开发(E-mail)ncuskzhengjingxia@163.com。

白春清，讲师，博士(E-mail) chunqingbai01@aliyun.com。

TS225.6;TQ641

A

1003-7969(2017)04-0047-06