8周游泳运动对糖尿病大鼠模型主动脉血管内皮细胞功能的影响

黄玫梅 尚画雨 夏 志 苏全生

(成都体育学院运动医学系，四川 成都 610041)

8周游泳运动对糖尿病大鼠模型主动脉血管内皮细胞功能的影响

黄玫梅 尚画雨1夏 志2苏全生

(成都体育学院运动医学系，四川 成都 610041)

目的 探讨长期游泳运动对2型糖尿病(T2DM)大鼠血管内皮细胞的影响及可能机制。方法 8周龄雄性Wistar大鼠高糖高脂饲料喂养联合链脲佐菌素(STZ)注射制备成T2DM大鼠模型后，随机分为空白对照组(C组)、单纯运动组(CE组)、糖尿病对照组(DM组)、糖尿病运动组(DME组)。CE组、DME组进行8 w游泳训练(6 d/w)，第1周前3 d练习时间分别为20、30和45 min，第4天起每天持续游泳60 min。运动8 w后测定各组血浆中血管性假性血友病因子(vWF)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)，以及胸主动脉中二酯酰甘油(DAG)、蛋白激酶C(PKC)的水平。结果 与DM组相比，DME组的血浆vWF、PAI-1含量以及胸主动脉中PKC活性均明显降低(P<0.05)，而DAG水平也有所降低，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 8 w游泳运动可降低vWF、PAI-1水平，减轻DM造成的血管内皮细胞损伤，对内皮细胞起保护作用，其机制可能与减少组织DAG的合成、抑制PKC途径的激活有关。

有氧运动；2型糖尿病；血管性假性血友病因子；纤溶酶原激活物抑制剂；蛋白激酶C

动脉粥样硬化、冠心病〔1〕等是导致糖尿病(DM)高致残率和病死率的主要原因，血管病变成为DM最主要的慢性并发症〔2〕。其中，2型糖尿病(T2DM)发生冠心病的风险是非糖尿病人群的2～4倍〔3〕。由于内皮功能紊乱是DM血管并发症的始动因素和最重要的病理生理学基础〔4〕，因此保护血管内皮细胞是防治DM血管并发症的关键。近年研究显示，有四条病理性通路与糖尿病血管并发症的发生与发展紧密相关：多元醇途径；己糖胺途径；糖基化终末产物(AGEs)形成途径和蛋白激酶C(PKC)途径〔5〕。目前，大多数研究都是从AGEs通路去研究药物对血管的保护机制，尚未见报道从二酯酰甘油(DAG)-PKC信号转导通路的角度研究长期游泳运动在DM大血管病变发病中的干预作用。本研究拟通过复制T2DM大鼠模型，观察8 w游泳运动后大鼠血浆中内皮依赖性调节蛋白和胸主动脉组织中DAG-PKC系统的变化，探讨其对T2DM大鼠血管内皮细胞的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取8周龄雄性Wistar大鼠，体重200～230 g，购自四川大学华西医学院动物实验中心，自由摄食、饮水，室温22℃～25℃；高糖高脂饲料配方〔6〕：10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸钠，66.5%基础饲料。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自成都三鹰生物技术有限公司；血糖仪购自美国强生公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司，超低温冰箱购自日本Sanyo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DM模型的制备与分组 45只Wistar大鼠适应性喂养1 w，随机抽取14只分为空白对照组(C组，n=7)和单纯运动组(CE组，n=7)，给予普通饲料喂养，其余31只给予高糖高脂喂养7 w后(期间死亡5只)，禁食不禁水12 h给予一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L，pH4.2的枸橼酸缓冲液中)30 mg/kg，同时C和CE组腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。72 h后用血糖仪检测非禁食血糖>16.7 mmol/L者作为T2DM大鼠〔7〕，成功20只，随机分为DM对照组(DM组，n=10)、DM+运动组(DME组，n=10)。

1.2.2 运动方案 采用改进的Ploug等〔8〕游泳训练方案，池(100 cm×70 cm×60 cm)水深50 cm，水温(30±2)℃。先进行2次适应性游泳练习，10 min/次。第1周前3 d训练时间分别为20 min、30 min和45 min，第4天起每天持续游泳60 min，每周运动6 d，共训练8 w。CE组和DME组进行训练，C组和DM组不予运动。

1.2.3 观察指标及检测方法 实验期间记录大鼠一般情况及行为改变，定时称重。分别于STZ注射前、运动8 w后禁食12 h测量各组大鼠血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)。使用血糖仪测定FBG，ELISA测定血清FINS；胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。运动8 w后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后取下腔静脉血，EDTA抗凝，4℃，3 000 r/min离心10 min，血浆分装入1.5 ml EP管，-80℃冻存，用于检测血浆血管性假性血友病因子(vWF)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)含量，然后迅速开胸腹腔，取出主动脉，做主动脉组织匀浆，检测主动脉DAG含量以及PKC活性。ELISA测定血浆中vWF、PAI-1和胸主动脉DAG的含量以及PKC活性，测定方法均严格按照试剂盒进行。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行LSD法。

2 结 果

2.1 一般情况 实验期间由于环境和饮食改变、DM慢性疾病状态和感染等原因导致大鼠死亡。C组、CE组、DM组、DME组最终进入统计的有效样本量分别为6、6、7、6只。DM大鼠活动减少，体毛无光泽，多食、多饮、多尿，明显消瘦。

2.2 各组体重的比较 适应性喂养1 w后，普通饲料喂养大鼠体重(242.00±34.52)g,与高糖高脂饲料喂养大鼠体重(233.30±24.87)g,无显著差异(P>0.05)。随着实验的进行，C组和CE组大鼠体重逐渐增加，DM组和DME组体重逐渐减轻，各组间无明显差异(P>0.05)。8 w运动后，C组与CE组体重无显著差异(P>0.05)，DM组体重显著低于C、CE组(P<0.01)；DME组体重也明显低于C、CE组(P<0.05)，较DM组增加并不显著(P>0.05)。见表1。

2.3 各组血糖比较 实验期间C组和CE组的血糖均为正常水平，且组间无明显差异(P>0.05)。在STZ注射前、开始运动前及运动后，DM和DME组的血糖水平均明显高于C组和CE组(P<0.01或P<0.05)。开始运动前，DM组和DME组血糖比较差异无统计学意义(P>0.05)。8 w运动后，DME组的血糖较DM组明显降低(P<0.05)。见表2。

表1 各组不同时间点体重的比较±s，g)

与C组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与CE组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

2.4 各组血清FINS和HOMA-IR的比较 实验期间C组和CE组的血清FINS和HOMA-IR均未有明显变化，且组间无显著差异(P>0.05)。STZ注射前，DM组和DME组的血清FINS和HOMA-IR均差异不显著(P>0.05)，仍明显高于C组和CE组(P<0.05或P<0.01)。8 w运动后，DM组的血清FINS显著低于C、CE组(P<0.01)，HOMA-IR显著高于C、CE组(P<0.01)；与DM组相比，DME组的血清FINS显著升高(P<0.01)，HOMA-IR水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表2 各组不同时间点血糖的比较

与C组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与CE组比较:3)P<0.05，4)P<0.01；与DM组比较:5)P<0.05，下表同

表3 各组不同时间点FINS及HOMA-IR的比较

2.5 各组血浆vWF和PAI-1的比较 8 w运动后，C组和CE组vWF、PAI-1的水平无明显差异(P>0.05)。DM组vWF、PAI-1的含量均显著高于C组和CE组(P<0.01)；与DM组相比，DME组vWF、PAI-1的水平明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组血浆vWF、PAI-1的比较

2.6 各组胸主动脉中DAG和PKC的比较 8 w运动后，C组和CE组DAG、PKC的水平无明显差异(P>0.05)；DM组的DAG含量明显高于CE组(P<0.05)，PKC活性也显著高于C、CE组(P<0.01)；而DME组的DAG、PKC水平升高不显著(P>0.05)。DME组与DM组相比，虽然DAG水平差异并不显著(P>0.05)，但仍表现出了下降的趋势，同时PKC的活性明显降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组DAG、PKC的比较

3 讨 论

近年来，研究表明，高血糖、高胰岛素环境、氧化应激及慢性炎症等均会导致血管内皮功能发生障碍，血液中的一系列内皮依赖性调节蛋白调控失衡从而产生各种血管并发症〔9〕。这些内皮调节蛋白主要包括vWF、PAI-1等。研究指出，适宜的有氧运动，能有效改善局部血流动力学，增加神经血流灌注，改善微循环，提高体内抗氧化物质水平，减轻炎症反应〔10〕。这为有氧运动防治DM并发症提供了理论依据。

本实验采用高糖高脂喂养联合小剂量STZ注射制备T2DM模型，结果发现建立的T2DM大鼠模型是成功的，与国内外学者研究结果一致〔11～13〕。

有资料显示〔14〕，当血管内皮受损时，内皮细胞中的vWF释放入血，与凝血因子Ⅷ结合成为载体，促进血小板黏附并聚集于受损的血管内皮下，启动血栓形成的第一步。因此，血浆中的vWF升高被认为是内皮细胞损伤及功能异常的标志〔15〕。PAI-1是机体纤溶系统的主要生理抑制剂，其浓度增高可引起血液中纤溶作用减弱，纤维蛋白沉积，促进血管基底膜增厚，从而加速动脉粥样硬化及血栓形成〔16〕。临床研究表明，T2DM患者血液处于高凝状态，vWF 水平明显高于健康成年人〔17〕；而患者血浆PAI-1水平升高造成纤溶活性降低是导致DM高凝状态的主要因素之一〔18〕。本实验提示8 w游泳运动能减轻T2DM大鼠内皮细胞损伤，增加抗凝和纤溶能力，延缓血管病变进程，与Montero等〔19〕报道的长期运动训练可以改善T2DM患者血管内皮功能的结果一致。

本实验还发现，T2DM大鼠8 w时DAG-PKC通路的确处于慢性激活状态，这与PKC途径发病学说是吻合的。PKC通常以无活性形式存在于胞质中，当受到外界刺激时移位至细胞膜而被DAG和钙激活〔20〕。研究表明，DM患者及动物的多种组织(如主动脉、肾小球、心脏等)中DAG含量增加〔5，21〕，其合成主要来源于从头合成途径，即高血糖经酵解产生中间产物，逐步酰化合成DAG〔22〕。细胞内DAG的合成与释放引起PKC的激活，造成血管基底膜增厚、通透性增加、内皮功能异常等，这是诱发DM多种血管并发症至关重要的一步〔5，22～24〕。Loganathan等〔25〕研究发现8 w运动干预可以使DM大鼠心肌纤维化程度明显减轻，同时心肌DAG含量显著下降，而PKC-βⅡ蛋白表达及活性均无明显变化，提示长期运动训练对DM大鼠心脏功能的保护作用与抑制其心肌DAG水平升高有关。Smith等〔26〕也报道，DM大鼠在8 w有氧运动后骨骼肌DAG、FAT/CD36、神经酰胺的水平均显著下降，从而改善IR。本研究结果表明，8 w游泳运动能通过减少细胞内DAG合成及抑制PKC途径的激活而减轻T2DM大鼠血管内皮损伤。综上所述，8 w游泳运动可降低T2DM大鼠FBG水平，改善IR，降低vWF、PAI-1水平，增加抗凝和纤溶能力，减轻DM造成的血管内皮损伤，对内皮细胞起保护作用，其机制可能与减少细胞内DAG的合成、抑制PKC途径的激活有关。

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〔2015-12-09修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

苏全生(1958-)，男，教授，主要从事运动性疲劳的机制与恢复研究。

黄玫梅(1985-)，女，硕士，助教，主要从事运动干预与健康促进研究。

R363

A

1005-9202(2017)08-1849-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.012

1 成都体育学院运动医学与健康学院 2 井冈山大学体育学院