Morris水迷宫训练对老年痴呆大鼠模型学习记忆能力及海马组织肿瘤坏死因子-α、超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影响

彭 璇 吴 刚 吴 昊 黄德斌

(湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

Morris水迷宫训练对老年痴呆大鼠模型学习记忆能力及海马组织肿瘤坏死因子-α、超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影响

彭 璇 吴 刚1吴 昊 黄德斌

(湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

目的 观察Morris水迷宫训练对老年痴呆(AD)大鼠学习记忆能力及海马组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影响。方法 随机将32只SD雄性大鼠分为假手术组、模型组、Morris水迷宫短期训练组和Morris水迷宫长期训练组；以穹隆-海马伞切断建立痴呆大鼠模型；运用Morris水迷宫进行训练；采用跳台实验以及水迷宫实验测试大鼠的学习和记忆能力；采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠海马组织TNF-α的水平，比色法检测大鼠海马组织SOD活性和MDA含量。结果 Morris水迷宫训练后AD大鼠学习记忆能力显著提高(P<0.01)；大鼠海马区TNF-α、MDA含量明显降低(P<0.05)、SOD含量明显升高(P<0.05)。结论 Morris水迷宫训练能明显改善大鼠的学习记忆能力，其机制可能与提高海马区SOD含量、降低TNF-α和MDA水平有关，而且水迷宫训练时间越长，恢复越明显。

Morris水迷宫训练；痴呆；学习和记忆能力；大脑海马

老年痴呆(AD)致死率仅次于心血管疾病、恶性肿瘤与脑卒中，高居全球死亡率的第四位〔1〕，其防治问题也成了当今需要解决的重大公共卫生难题。研究表明，体力与脑力活动量的增加有助预防AD〔2,3〕。而英国临床心理学家Morris于1984年设计出用于研究大鼠空间学习记忆的装置——Morris水迷宫(MWM)〔4〕，该装置主要针对大鼠的学习记忆、智力与衰老、AD、行为生物学等方面的研究。基于此，本研究通过穹窿-海马伞损伤法制备AD模型，观察水迷宫训练对AD大鼠学习记忆能力的影响，检测海马组织肿瘤坏死因子(TNF)-α水平、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，拟从自由基代谢方面来探讨水迷宫训练防治AD的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取32只12个月龄雄性SD大鼠，体重400～450〔平均(420±20)〕g，均来源于湖北民族学院动物实验中心。大鼠在实验前，对其进行为期1 w的适应性训练(温度20℃，湿度70%)。经MWM测试筛选，将不合格大鼠剔除，剩余32只合格大鼠，按照随机平均原则，分为模型组、假手术组、长期训练组和短期训练组。实施实验后，不对模型组开展训练刺激，其他同假手术组。MWM长期、短期训练组造模后与造模前训练方法一致同，长期训练组：造模后第6天，开展为期40 d的训练；短期训练组：造模后第26天，开展为期20 d的训练。

1.2 实验试剂及仪器 MDA试剂盒(上海信裕生物技术有限公司)，SOD试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)；TNF-α酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(上海信然生物技术有限公司)；Hans水迷宫训练仪(广州飞迪生物科技有限公司，型号XR-XM101)；MWM及水迷宫记录分析系统(中国医学科学院药物研究所研制,型号：DigBehv-MR);Ultra-TurraxT25匀浆机(德国JANKE-KUNKEL公司)；颅脑立体定位仪(天津市医疗器械研究所)；牙科钻(上海岭之崎精密工具公司)大鼠跳台仪(中国医科院药物研究所，型号：DTT-2)；微电极脑立体定位仪(西北光明仪器厂，型号：WDT-11)。

1.3 方法

1.3.1 动物水迷宫训练 MWM操作系统：水桶注入清水到预定水池高度(距桶面5 cm)，放入适量黑色碳素墨水，使水面浑浊至不透明，将桶内水温加热到23℃～25℃，把水池平均分为四个象限，即：东北、西北、西南、东南，并将站台固定在四个象限中心位置，其圆心距为23 cm，浸于水池液平面下3 cm。先将 AD 模型鼠放入水池中，不在平台位置投放，进行为期3 min的自由游泳，目的在于熟悉迷宫内的环境；再将大鼠头面向池壁，以四个象限为核心，在其中部池壁的位置，将大鼠轻放到水池，使其自行寻找站台位置。每天训练两个时段(间隔6 h)，每段对其训练4次，每次训练间隔时间为60 min。训练时，将大鼠面向池壁随机放入水池内任一入水点，如果大鼠在规定时间内(120 s)未游入平台，须将其引至平台停留20 s，再放回笼中,此时逃避潜伏期就记为120 s。在第41天，将各组大鼠再次按照以上方法进行为期5 d的空间学习记忆能力训练，再测量潜伏期，即大鼠寻找并爬上平台时所需时间，并观察大鼠对水迷宫学习记忆的获取能力、撤去平台后在120 s内跨过原平台相应位置的次数，即定位航行实验和空间搜索实验测试。

1.3.2 跳台试验 设置体积为15 cm×30 cm×30 cm的被动回避反应箱作为跳台试验装置，箱内放置一个橡胶圆台作为安全范围，动物可停留在安全范围内逃避电击。装置完毕后，将大鼠放入箱内120 s，使其适应环境，40 V交流电通入，计时从大鼠跳入安全范围内开始，到大鼠再次从安全台跳下(潜伏期时间)，同步记录300 s内大鼠跳出安全范围被电击的次数，将被点击次数记为错误次数。所有大鼠于造模后5 d、造模后46 d(水迷宫训练刺激结束后)开展跳台实验测试。

1.4 化学指标测定及结果判定 腹腔麻醉选取10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的剂量，麻醉完毕后断头，在操作台上迅速分离出海马组织。根据1 g海马组织样，加入4℃预冷的生理盐水，13 500 r/min离心，低温匀浆时间10 s/次，间隔30 s，连续4次，制备出10%的组织匀浆，后低温低速(4℃，3 000 r/min)离心15 min，取上清液，-40℃保存。采用考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量；海马区炎性因子TNF-α含量水平采用ELISA测定；海马组织匀浆中SOD和MDA含量用比色法检测。上述测定根据相关试剂盒说明书的步骤进行严格操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件对数据的组间比较进行t检验。

2 结 果

2.1 跳台实验法测定大鼠学习记忆能力 造模后5 d，模型组、短期训练组、长期训练组大鼠跳台潜伏时间较假手术组显著缩短(P<0.01)；造模后46 d，模型组虽然较假手术组有所降低，但是还是较造模后5 d时有所延长(P<0.05)，长期训练组较造模后5 d显著延长(P<0.01)。见表1。造模后5 d，模型组、短期训练组、长期训练组大鼠跳台实验的错误次数较假手术组显著增多(P<0.01)；造模后46 d，模型组与假手术组相比，错误次数明显增多，但与造模后5 d相比还是有所减少(P<0.05)，短期训练组与模型组相比，错误次数明显降低(P<0.05)，长期训练组与模型组相比，错误次数有显著降低(P<0.01)。见表2。

表1 大鼠跳台潜伏时间实验结果

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与本组5 d比较：3)P<0.05

表2 各组大鼠跳台实验的错误次数比较±s，次，n=8)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；与本组5 d比较：4)P<0.05

2.2 水迷宫实验测定大鼠学习记忆能力 造模46 d后，模型组大鼠的逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.01)；长期训练组较模型组逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)，而短期训练组其逃避潜伏期也有所缩短，但无显著差异(P>0.05)。模型组大鼠穿越平台次数明显少于假手术组(P<0.01)，长期训练组与模型组相比，次数增加尤为明显(P<0.01)。见表3。

2.3 水迷宫训练对AD大鼠海马区TNF-α、MDA和SOD含量的影响 造模后46 d，模型组TNF-α较假手术组明显升高(P<0.01)，长、短期训练组与模型组相比明显降低(P<0.05)。模型组MDA较假手术组明显升高(P<0.05)，短期训练组、长期训练组与模型组相比都明显降低(P<0.05)，长期训练组与短期训练组相比有明显降低(P<0.05)。模型组SOD活性较假手术组明显降低(P<0.05)；长期训练组SOD活性较模型组明显升高(P<0.05)，较短期训练组明显升高(P<0.05)。见表4。

表3 各组大鼠水迷宫实验的学习记忆能力比较±s,n=8)

与假手术组比较:1)P<0.01，与模型组比较:2)P<0.01

表4 各组大鼠海马区TNF-α、MDA和 SOD含量的比较

与假手术组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与模型组比较：3)P<0.05；与短期训练组比较：4)P<0.05

3 讨 论

原发性AD作为一种常见的神经系统退行性疾病，临床主要表现为运动能力、思维能力、感觉能力、记忆力、判断力等降低。目前，AD的发病机制尚不明确。有研究显示〔5〕，作为中枢神经系统的最主要组成部分之一，海马组织参与了大脑信息贮存、记忆等重要功能，并在学习、记忆以及情绪应激过程中扮演了不可替代的角色。本研究采用穹窿-海马伞损伤法制备的AD动物模型〔6〕，能在一定程度上模拟AD，造成大鼠学习记忆功能的损害、乙酰胆碱等生化递质的改变，海马神经细胞等一系列AD的病理改变，这对于研究AD的早期过程和预防治疗具有一定的说服力和代表性，可用于监测AD海马区炎症介质含量和功能的变化。

本研究提示水迷宫训练可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等途径对抗海马损伤，改善认知功能，对AD的防治起到一定的作用。老年人经常从事脑力劳动，可增强学习记忆能力，有效防治AD。这种改善学习记忆能力的作用可能与增强动物海马部位SOD含量，减少炎症介质TNF-α和膜脂质过氧化物MDA的水平以及发挥抗氧化的作用有关。在临床中，通过对AD、帕金森、脑血管疾病患者进行智力训练，可明显改善症状〔7〕。TNF-α作为一种重要的炎症介质，能够刺激细胞产生大量活性氧簇(ROS);而补体受体又可以同超氧自由基反应生成MDA，后者介导膜脂质过氧化，损伤血脑屏障及脑细胞膜。因此，增多的炎症介质可透过损伤的血脑屏障及受损的细胞膜，进一步加重其他因子引起的氧化应激和神经退化〔8〕，从而形成恶性循环，最终导致神经元凋亡和坏死，促进AD病情的加重。

综上，穹窿-海马伞损伤诱导AD大鼠的模型可通过增加炎症介质TNF-α造成大鼠海马区的氧化应激损伤，水迷宫训练能够增加SOD的活性〔9〕，具有抗氧化效应，有利于清除血液和脑组织中氧自由基，减轻海马神经元损伤，保护海马神经元，维系胆碱能神经的可塑性。这可能是改善AD模型大鼠学习记忆功能的机制之一。水迷宫训练具有较好的改善机体自由基代谢的作用，使机体的抗氧化能力增强，从而减轻突触超微结构损伤，其改善AD大鼠记忆、学习能力可能与此有关。

1 李 昂，殷淑琴，徐 勇，等.2010-2030年中国老年期痴呆的预测〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(13):3708-11.

2 刘 爽,张玉莲，周 震.老年性痴呆流行病学研究现状〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(10):1455-8.

3 Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.J Neurosci Methods,1984;11(1):47-60．

4 Morris RGM.Spatial localization does not require the presence of local cues〔J〕.Learn Motiv,1981;12:239.

5 王绪平，呙登俊，陈 宇,等.Morris水迷宫实验评价血管性痴呆大鼠模型的学习记忆能力〔J〕.中华中医药学刊，2013;31(1):99-101.

6 陶 莉,王 诗,谢剑梅,等．芦荟大黄素对痴呆小鼠学习记忆功能的改善研究〔J〕.现代食品科技,2014;30(12):7-10.

7 方 松,余化霖.Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展〔J〕.国际病理科学与临床杂志,2010;30(4):321-5.

8 张静爽,王 蓉.阿尔茨海默病发生机制的研究进展〔J〕.首都医科大学学报,2014;35(6):721-5.

9 Shema R,Sacktor TC,Dudai Y.Rapid erasure of long-term memory associations in the cortex by an inhibitor of PKM zeta〔J〕.Science,2007;317(5840):951-3.

〔2015-12-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

Influence of Morris water maze training on Azheimer's disease rats learning and memory ability and the expressions of TNF-α,SOD and MDA in hippocampal tissue

PENG Xuan,WU Gang,WU Hao,etal.

Medical College of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,Hubei,China

Objective To investigate the protective effect of water maze training on Alzheimer,s disease (AD)rats.Methods 32 SD rats were randomly divided into sham,model,short-term Morris water-maze training (short-term) and long-term Morris water-maze training (long-term) groups.Rat model of AD was made by transection of rat fimbria-fornix.Rats in these groups were tested for spatial learning and memory ability in Step-down Test and Morris water maze.Then,the brains were removed and hippocampal homogenate were prepared.Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to measure the level of TNF-α,colorimetric method was used to detect the content of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in the hippocampus homogenate.Results Morris water-maze training,learning and memory ability of AD rat was increased obviously,TNF-α and MDA were reduced,SOD was increased in hippocampal homogenate(P<0.05).Conclusions Water maze training can improve the spatial learning and memory ability of AD rats made by transaction of fimbria-fornix by enhancing the content of SOD and reducing TNF-α and MDA levels,and longer training and better effect.

Morris water maze training;AD;Learning and memory ability;Hippocampus

国家自然科学基金资助项目(No.81360654)

吴 刚(1969-)，男，硕士，讲师，主要从事神经解剖学研究。

彭 璇(1981-)，女，在读博士，副教授，主要从事分子病理生理学研究。

R73-3

A

1005-9202(2017)08-1833-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.005

1 湖北民族学院医学院病理解剖学教研室