幽门螺杆菌相关性胃腺癌中IL-37的表达及意义

龚谋春，方晓明，姚 宁，刘慧慧，陈琪枫，刘桂宝

·论 著·

幽门螺杆菌相关性胃腺癌中IL-37的表达及意义

龚谋春，方晓明，姚 宁，刘慧慧，陈琪枫，刘桂宝

目的 探讨白细胞介素37(IL-37)在幽门螺杆菌(HP)相关性胃腺癌[HP(+)胃腺癌]中的表达及意义。方法 选取2014年1月至2015年12月解放军第117医院收治胃腺癌78例(HP+ 46例、HP- 32例)，同期门诊HP(+)胃溃疡及HP(-)正常患者各30例。采用酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测各组血浆IL-37蛋白表达；Western blot检测HP(+)和HP(-)胃腺癌组癌组织内IL-37蛋白表达。逆转录(RT)-PCR检测HP(+)与HP(-)胃腺癌癌组织IL-37 mRNA表达。结果 ①各组血浆IL-37蛋白表达情况：HP(-)正常组与HP(-)胃腺癌组相比，差异无统计学意义(P>0.01)；HP(+)溃疡组高于HP(-)正常组和HP(-)胃腺癌组，差异均有统计学意义(P<0.01)；HP(+)胃腺癌组高于HP(+)溃疡组、HP(-)正常组及HP(-)胃腺癌组，差异均有统计学意义(P<0.01)。②胃腺癌组癌组织内IL-37蛋白表达情况：HP(+)组高于HP(-)组，差异有统计学意义。③胃腺癌组癌组织内IL-37 mRNA表达情况：HP(+)组高于HP(-)组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HP感染后血浆IL-37升高，HP(+)胃癌组织内IL-37蛋白及mRNA表达均升高；IL-37表达升高与HP(+)胃腺癌的发生密切相关。

幽门螺杆菌；胃腺癌；白细胞介素37

幽门螺杆菌(HP)感染是人类最高发的慢性细菌感染之一，全世界范围内，约有半数人口感染HP。HP感染与胃腺癌关系密切，在1994年WHO就把HP列为胃腺癌I类致癌危险因素，感染者发病率较非感染者高3～6倍[1-2]。白细胞介素37(IL-37)在炎症性疾病和自身免疫性疾病中呈高表达，研究表明，IL-37具有强大抗炎能力，能够调节多种细胞因子表达和机体免疫功能[3-5]。胃腺癌是一个与慢性炎症密切相关的恶性肿瘤，我们检测了IL-37在这类胃腺癌血浆、癌组织及癌旁组织的表达情况，探讨IL-37与HP相关性胃腺癌发病的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2014年1月至2015年12月在我科住院，有我院胃镜检查、14C呼气试验结果及手术标本的胃腺癌78例[HP(+) 46例、HP(-) 32例]，同期门诊HP(+)胃溃疡及HP(-)正常患者各30例，平均年龄为(61.8±6.0)岁。排除标准：妊娠，有影响全身的心血管、肾、肝等基础疾病，有合并其他肿瘤，有其他自身免疫性疾病，6个月内有手术、外伤史，6个月内合并急慢性感染及有药物使用史的患者。本研究方案经过我院伦理委员会批准，研究对象知情同意并签署知情同意书。14C呼气试验及胃镜结果由我院消化科内镜中心完成，胃腺癌诊断由我院病理科完成。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 取入选病例清晨空腹8 h以上静脉血3 mL，3000 r/min离心10 min，收集上清，于-80 ℃冰箱保存待检。采用双抗体夹心ELISA法检测血浆IL-37水平，操作过程严格按照产品说明进行。IL-37 ELISA试剂盒购自瑞士Adipogen 公司，最低检测浓度为10 pg/mL；胃癌组织切除离体后5 min内取肿瘤中央无坏死及出血部位组织，癌旁组织距肿瘤5 cm左右，组织大小均约1 cm×0.5 cm×0.5 cm，经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，立即置于液氮罐中保存，用于IL-37 mRNA水平和蛋白检测。切除、清扫大体标本送病理科检查。

1.2.2 Western blot检测组织IL-37蛋白的表达水平 组织标本经过蛋白样品制备、蛋白定量、蛋白电泳、转膜、抗体杂交、发光检测后，结果以灰度值表示。检测所用的IL-37一抗为兔抗人单抗隆抗体IgG购于美国Abcam公司。

1.2.3 逆转录PCR 技术检测组织IL-37 mRNA的表达水平 取备用的组织，组织经过蛋白裂解液裂解、匀浆，TRIzol试剂法提取总RNA；最后逆转录为cDNA。相关引物委托上海生工完成，IL-37引物序列上游：5′-AGTGCTGCTTAGAAGACCCGG-3′，下游：5′-AGAGTCCAGGACCAGTACTTTGTG A-3′。以β肌动蛋白(β-actin)作为内参照，其引物序列上游: 5′-TGGCACTCCAGCACAATGAA-3′，下游:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反应体系为20 μL，进行实时PCR反应。反应条件：采用两步法PCR扩增标准程序，预变性，95 ℃ 30 s；PCR反应，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40 个循环。记录循环阈值(Ct值)，以相对定量方法计算IL-37 mRNA的表达水平。

Western blot检测IL-37蛋白表达，用ImageJ2x软件分析蛋白条带，IL-37蛋白相对含量以目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值表示。RT-PCR检测组织IL-37 mRNA表达，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Band Leader 3.0凝胶图像分析系统分析，IL-37 mRNA的值用IL-37与β-actin扫描密度值之比表示。

2 结 果

2.1 各组血浆IL-37蛋白表达情况 血浆IL-37蛋白水平由HP(-)正常组、HP(-)胃腺癌组、HP(+)溃疡组、HP(+)胃癌腺组依次升高。HP(+)溃疡组高于HP(-)正常组和HP(-)胃腺癌组，HP(+)胃腺癌组高于其他组，差异均有统计学意义(P<0.01)；HP(-)正常组和HP(-)胃腺癌组相比，差异无统计学意义(P>0.01)，见表1。

组别nIL-37HP(-)正常组3019.51±4.61*#HP(-)胃腺癌组3223.64±6.72*#HP(+)溃疡组3066.11±20.92*HP(+)胃癌腺组4678.97±24.67与HP(+)胃癌腺组比较,*P<0.01;与HP(+)溃疡组比较,#P<0.01

2.2 胃腺癌组癌旁组织及癌组织IL-37蛋白表达情况 HP(+)和HP(-)胃腺癌组癌旁组织及癌组织均有IL-37蛋白的表达，癌组织IL-37蛋白均高于癌旁组织，见图1；分析条带光密度值，计算各组IL-37蛋白与GAPDH光密度的比值，HP(+)胃腺癌组癌组织内IL-37蛋白表达高于HP(-)胃腺癌组癌组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

1、3：HP(-)胃腺癌组癌旁组织及癌组织；2、4：HP(+)胃腺癌组癌旁组织及癌组织。GAPDH：内参；IL-37：白细胞介素37

图1 2组胃腺癌癌旁组织及癌组织内IL-37蛋白电泳图

组别nIL-37/GAPDHHP(-)胃腺癌组32 癌旁组织0.212±0.046 癌组织0.764±0.063*HP(+)胃癌腺组46 癌旁组织0.372±0.013 癌组织1.330±0.065*#与本组癌旁组织比较,*P<0.01;与HP(-)胃腺癌组癌组织比较,#P<0.01

2.3 胃腺癌癌组织内IL-37mRNA表达 HP(+)胃腺癌组癌组织IL-37 mRNA表达显著高于HP(-)胃腺癌组，表达水平分别为(0.4787±0.0707)和(0.1817±0.0428)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

与HP(-)胃腺癌组比较，*P<0.01

图2 HP(+)与HP(-)胃腺癌癌组织中IL-37mRNA表达

3 讨 论

HP感染是人类最高发的慢性细菌感染之一，全世界范围内，约有半数人口感染HP。HP感染与胃腺癌关系密切，感染者发病率较非感染者高3～6倍。在1994年，WHO就把HP列为胃腺癌I类致癌危险因素。当人体胃部黏膜表皮受到HP感染后容易造成局部区域细胞变性、坏死等，引起胃部组织出现萎缩、分化障碍，导致肠化生，甚至引起异型增生，最终演变为胃腺癌[6]。因此，HP相关性胃腺癌是个与慢性炎症密切相关性恶性肿瘤，这个过程是一个慢性反复的炎症过程[7-8]。白细胞介素1(IL-1)家族被认为是调控炎症反应的重要因子，可能与胃恶性肿瘤相关[9]。IL-37是新近发现的IL-1家族中的一员，在体内及体外均被证实能抑制多种促炎因子的表达，具有强大抗炎能力[10]。已有研究表明，IL-37在非小细胞肺癌中可抑制肿瘤血管生成的作用[11]，我们对IL-37在HP相关性胃癌之间的关系作了初步探讨。

我们的研究发现，HP(-)组和HP(-)胃腺癌组血浆IL-37表达无明显差异，HP(+)溃疡组血浆IL-37蛋白表达高于HP(-)组和HP(-)胃腺癌组。可以认为HP感染后胃组织存在慢性炎症，血浆IL-37蛋白表达升高是机体炎症反应的表现。这与既往研究认为IL-37表达在炎症性疾病中表达增高相一致。我们还发现，HP(+)胃腺癌癌组织与HP(-)胃腺癌癌组织标本相比，HP(+)胃腺癌组织内IL-37蛋白及mRNA表达均升高，这提示从胃组织HP慢性感染开始至胃组织恶变的全过程中，均存在IL-37表达升高这一改变。我们也检测了2组胃腺癌组癌组织与癌旁组织内IL-37蛋白表达，发现胃腺癌组织中IL-37蛋白与癌旁组织相比均升高，可能提示胃组织发生恶变后，不管有无幽门螺杆菌感染，均存在有包括免疫细胞的浸润在内的炎症性改变。

对IL-37转基因小鼠体内DC的活性研究发现，IL-37可显著抑制经LPS刺激后树突状细胞(dendritic cell, DC)活性，其机制为显著状少DC表面CD86和主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)的平均表达量(由73%下降为47%)[4]。在HP感染的慢性炎症过程中，病情有浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠化-异型增生-癌变的变化过程[12]。免疫监视的缺失在组织发生恶变过程中起到至关重要。DC是免疫反应起始环节，在免疫应答中起着关键的作用，随着IL-37水平升高，DC活性的功能减弱，抑制了免疫细胞的趋化及关键的某些免疫反应，可能是胃腺癌形成的因素之一。研究表明IL-37主要有两条作用途径：①分泌到胞外通过IL-18R发挥作用；②转运到细胞核内与Smad3等因子相互作用影响多个因子的转录[3]。在对胃癌的发病机制研究发现，Smad3基因是一个重要环节，敲除小鼠Smad3后发现，小鼠胃小弯侧开始发生肠化生、侵袭性胃癌形成[13]。Smad3 过表达能显著减少胃腺癌细胞的成瘤性，而表达减少则胃癌的发生率显著增高[14-15]。因此，我们推测，HP(+)胃腺癌中IL-37升高，可能与Smad3这个胃癌早期形成过程中的关键性信号通路相互作用有关。本研究期间中，未获得HP(-)正常胃组织标本，因此未进行正常胃组织与胃腺癌组织及癌旁组织IL-37蛋白与mRNA表达的比较。两者关系需进一步获得标本后验证。

总之，HP相关性胃腺癌是与慢性炎症密切相关的恶性肿瘤，IL-37作为重要的抗炎因子在HP的慢性感染过程中表达升高。HP(+)胃腺癌病例血浆IL-37蛋白表达均高于正常病例、HP(+)溃疡病例及HP(-)胃腺癌病例，HP(+)胃腺癌癌组织内IL-37表达高于HP(-)胃腺癌组织。因此，IL-37表达与HP相关性胃腺癌密切相关，在HP相关性胃腺癌的发生、发展中的作用及机制需进一步研究。

[1] Conteduca V, Sansonno D, Lauletta G,etal. H. pylori infection and gastric cancer: state of the art (review)[J]. Int J Oncol, 2013,42(1):5-18.

[2] Meng W, Bai B, Sheng L,etal. Role of Helicobacter pylori in gastric cancer: advances and controversies[J]. Discov Med, 2015,20(111):285-293.

[3] Boraschi D, Lucchesi D, Hainzl S,etal. IL-37: a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family[J]. Eur Cytokine Netw, 2011,22(3):127-147..

[4] Nold MF, Nold-Petry CA, Zepp JA,etal. IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity[J]. Nat Immunol, 2010,11(11):1014-1022.

[5] 张 燕, 熊 霞. IL-37及其与疾病相关性的研究进展[J]. 基础医学与临床, 2015,35(4):549-553.

[6] Valenzuela MA, Canales J, Corvalán AH,etal. Helicobacter pylori-induced inflammation and epigenetic changes during gastric carcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(45):12742-12756.

[7] 蔡 慧, 丁一波, 马立业, 等. 炎症信号网络及其关键分子事件在胃癌进化发育中的作用[J]. 东南国防医药, 2016,18(3):290-293.

[8] 吴楠蝶, 魏 嘉, 刘宝瑞. 胃癌分子靶向治疗的研究进展[J]. 医学研究生学报, 2014,27(12):1318-1322.

[9] 向 瑜, 杨致邦, 陈 瀑, 等. 白细胞介素-1B和肿瘤坏死因子-α基因多态性与胃溃疡、胃癌易感性的相关性[J]. 中国生物制品学杂志, 2009,22(10):1010-1014.

[10] Chen HM, Fujita M. IL-37: a new player in immune tolerance[J]. Cytokine, 2015,72(1):113-114.

[11] Ge G, Wang A, Yang J,etal. Interleukin-37 suppresses tumor growth through inhibition of angiogenesis in non-small cell lung cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35(1):13.

[12] 席银雪, 宋 鑫, 陈 洁, 等. syndecan-1在胃黏膜癌变不同阶段组织中的表达及意义[J]. 中华肿瘤杂志, 2007,29(3):193-196.

[13] Nam KT, O'Neal R, Lee YS,etal. Gastric tumor development in Smad3-deficient mice initiates from forestomach/glandular transition zone along the lesser curvature[J]. Lab Invest, 2012,92(6):883-895.

[14] Han SU, Kim HT, Seong DH,etal. Loss of the Smad3 expression increases susceptibility to tumorigenicity in human gastric cancer[J]. Oncogene, 2004,23(7):1333-1341.

[15] 王运涛, 吴小涛, 郑启新, 等. 转化生长因子β1/Smad3促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究[J]. 医学研究生学报, 2007,20(7):689-692.

(本文编辑:叶华珍； 英文编辑：王建东)

IL-37 level in HP positive patients with gastric adenocarcinoma

GONG Mou-chun, FANG Xiao-ming, YAO Ning, LIU Hui-hui, CHEN Qi-feng, LIU Gui-bao

(DepartmentofGeneralSurgery,the117thHospitalofPLA，Hangzhou310004，Zhejiang，China)

Objective To investigate the expression of interleukin-37 in Helicobacter pylori(HP) positive patients with gastric adenocarcinoma. Methods 78 cases of patients with gastric adenocarcinoma recruited in our hospital from January 2014 to December 2015 were selected. Among them, seventy-eight inpatients with gastric adenocarcinoma [HP(+) 46 cases, HP(-) 32 cases], and 30 outpatients with HP(+) gastric ulcer, and 30 outpatients with HP(-) were studied. The plasma IL-37 levels of each group were determined by ELISA. Western blot was used to test IL-37 protein in cancer tissue of HP(+) and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma. And RT-PCR was used to test IL-37 mRNA in cancer tissue of HP(+) and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma tissue. Results ① Expression of plasma IL-37 protein in each group: there were no statistically significant difference between HP(-) group and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P>0.01). It was increased signifcantly in the HP(+) ulcer group compared with HP(-) group and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01), and it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with other groups (P<0.01). ② Expression of IL-37 protien in gastric adenocarcinoma tissue: it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01). ③ Expression of IL-37 mRNA level in gastric adenocarcinoma tissue: it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01). Conclusion The plasma IL-37 level was increased when patients were infected by HP, and the expression of IL-37 protein and mRNA were increased significantly in gastric adenocarcinoma tissue of HP (+) patient with gastric adenocarcinoma. IL-37 might involved in the occurrence and development of gastric adenocarcinoma in patients with HP.

Helicobacter pylori; Gastric adenocarcinoma; Interleukin-37

310004杭州，解放军第117医院普外科

方晓明，E-mail：FXM117@163.com

龚谋春，方晓明，姚 宁,等.幽门螺杆菌相关性胃腺癌中IL-37的表达及意义[J].东南国防医药，2017,19(2):153-156.

R735.2

A

1672-271X(2017)02-0153-04

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.02.010

2016-08-28;

2017-02-18)